概要：

在这项工作中，我们运用四种不同的软链段合成了几种基于 MDI 的聚碳酸酯基聚氨酯（PCU），包含两种脂肪族大分子二醇（聚（己基，乙基）碳酸酯二醇，MW 分别为 2017 和 865）和两种芳香族大分子二醇 （MW 2000 和 1000，分别），与 MDI 的摩尔比不同。我们证明这些聚合物表示出不同水平的微相分别，这进一步影响了它们的名义蛋白质吸附、血小板活化以及细胞附着和生长。基于聚（己基，乙基）碳酸酯二醇的聚氨酯，分子量为 2017，MDI/大分子二醇/扩链剂的摩尔比为 3/2/1 或 4/3/1，可完成更大的微相分别以及杰出的生物相容性和 生物稳定性。

一、简介

聚氨酯因其良好的血液相容性和机械性能而被普遍用作心血管生物资料。近年来，聚碳酸酯基聚氨酯（PCU）已被用于替代更传统的生物医学聚醚聚氨酯，由于据报道它们具有抗氧化生物降解性。由于硬链段和软链段之间的热力学不相容性，聚氨酯表示出两相微观结构，即微相分别。微相分别招致资料的高变形性和机械强度。域结构也能够解释聚合物名义的血液相容性。特别是，Huang 等人发现具有适合相分别或名义组成的聚氨酯名义具有最低的纤维蛋白原/白蛋白吸附比。这些结构域会影响蛋白质在名义的吸附，可能是由于结构域的大小与蛋白质的大小相似。Grasel 和 Cooper 还表明，相分别得更好的资料具有较低的血小板和纤维蛋白原堆积水平。除了却构域结构外，许多其他要素，包含名义化学、亲水性和粗糙度，都可能影响蛋白质吸附、生物相容性、细胞生长和血小板活化。

在本研讨中，我们运用四种软链段、两种脂肪族大二醇（MW 分别为 2017 和 865）和两种芳香族大二醇（分别为 MW 2000 和 1000）合成了四个系列的 MDI 基聚碳酸酯基聚氨酯。与 MDI 的摩尔比。将聚合物浇铸成薄膜。对微相分别以及名义性质中止了表征，并与这些聚氨酯在体外的蛋白质吸附、血小板反响和细胞亲和力的察看结果相关联。这些薄膜也被植入大鼠皮下，以证明它们不同寻常的生物稳定性。基于这些评价选择了最佳配方。

二、实验

2.1. 聚氨酯合成

经过传统的两步溶液聚合合成了 12 种聚（碳酸酯）聚氨酯，如表中所列。

表格1：本研讨中合成或运用的聚氨酯的配方清单

关于 A2、A1、J2 和 J1，请参见图 1。

表 1. 运用的硬链段是 4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI，Bayer，Germany）和 cis-2-butene1,4-diol（作为扩链剂，Sigma，USA）。软链段要么是聚（己基，乙基）碳酸酯二醇（MW 2017 和 865，购自美国 Stahl），要么是芳族大二醇（MW 2000 和 1000，购自 Nippon Polyurethane Industry，Japan），如图 1 所示。1. 预聚物是经过 MDI 与软链段在 70°C 下以 2:1、3:2 或 4:3 的摩尔比反响，直到 NCO 的量抵达经过二丁胺滴定法测定的理论值。然后将预聚物与二甲基乙酰胺溶剂、2-butene1,4-diol 和 0.1% T-12 混合，得到 45 wt.% 的固含量。反响在 75°C 下中止，直到异氰酸酯基团消逝，红外光谱证明。经过滴入甲醇/水 (3:1) 的混合物中将产品制成颗粒。经过在甲苯中萃取进一步纯化颗粒，单调并以颗粒方式贮存。为了制备薄膜，将聚合物重新溶解在溶剂中，浇铸到聚四氟乙烯板上并剥离以中止体积表征或浇铸到圆形玻璃盖玻片（直径 15 mm , Matsunami, Japan) 用于名义和生物测试。

图 1. 研讨中运用的聚碳酸酯二醇 A2、A1、J2 和 J1。

2.2. 分子量、玻璃化转变温度和机械测试

每种聚合物的重均分子量 (MW) 以及分子量散布指数 (MW/Mn) 经过 GPC (Thermo Separation System P1000, USA) 运用四氢呋喃 (THF) 作为洗脱剂以 1.0 的流速取得 ml/min 和聚苯乙烯作为规范。

经过动态机械剖析仪（DMA 2980，TA Instrument，USA）丈量玻璃化转变温度（Tg）。将样品冷却至-120°C，然后以5°C/min 的速率加热至20°C。样品的 Tg 取自损耗角正切曲线的最高点。

拉伸强度、100% 模量（100% 应变下的割线模量）和断裂伸长率经过通用测试仪器（Hung Ta HT-8504，台湾）丈量。依据 ASTM，样品尺寸为 38.09 mm × 4.74 mm。在室温下以 100 N/min 的恒定速度对样品中止丈量。数据取为至少三个丈量值的平均值。

2.3. 接触角、名义元素和名义图像

薄膜的水接触角是在 25°C 和 70% 的相对湿度下经过运用去离子水的静滴法 (20ul) 丈量的。运用接触角计（CA-D，Kyowa Interface Science，Japan）读取水接触角。在薄膜的不同部分至少读取五个读数（n = 5）并取平均值。运用 ESCA (ESCA-210, VG,UK) 剖析名义元素。剖析功率为 216 W。起飞角固定为 45°。Mg是X射线管的金属靶。X 射线源可提供 K = 1253.6 eV。操作高扫描扫描（0-1000 eV）（经过能量 50 eV，光斑尺寸 1 eV）以取得名义上的原子散布。经过内置软件对高分辨率 C1S 光谱（经过能量 20 eV，光斑大小 0.1 eV）中止去卷积和曲线拟合，以剖析碳原子的化学键合状态。一切丈量均在高真空 (1×10-9 Torr) 下中止。一些薄膜的名义图像和平均粗糙度是在 Topometrix Explorer（美国）多方式原子力显微镜（AFM）上取得的，运用三脚架硅尖端（125 um，尖端半径 5-10 um），扫描速度为 1/us。

2.4. 蛋白质吸附

本研讨运用的蛋白质是浓度为 30 mg/ml 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的牛血清白蛋白 (Sigma)，以及浓度为 3 mg/ml 的 PBS 中的牛血浆纤维蛋白原 (1-S 型，Sigma) . 将玻璃盖玻片上的薄膜用 70% 乙醇消毒 30 分钟，然后放入 24 孔组织培育板底部。将样品在 1 ml 蛋白质溶液中在 37°C 下孵育 72 小时。温育后，去除蛋白质溶液并用PBS当心冲洗薄膜一次。样品上吸附的蛋白质经过用 1 ml PBS 用量移液管重复抽吸和冲洗来解吸。经过紫外可见光度计在 202 和 210 nm (Hitachi, Japan) 丈量 PBS 中解吸的蛋白质。讲演的吸附量是三个样品的丈量平均值。

2.5. 血小板粘附和活化

用于实验的富血小板血浆（PRP）来自台中市中华血液基金会。血小板计数约为~1×10的6次方血小板/ul。将样品置于 24 孔组织培育板中，向孔中参与 1 ml PRP。它们在 37°C 下培育 1 小时。然后取出样品并用 HEPES 缓冲盐水悄然冲洗以去除涣散吸附的血小板。一式两份，用胰蛋白酶分别粘附的血小板，用血液剖析仪（Sysmex F-800，美国）计数。在另一份重复中，将样品固定在 HEPES 缓冲的戊二醛中，并经过规范程序在扫描电子显微镜 (SEM; Topcon ABT-150S) 下中止可视化脱水。在本研讨中，血小板活化过程中常见的形态学变更（包含五个阶段）被常规用作工具 [11] 来定量定义血小板的活化水平：0，圆形（未活化）；1/4，树突状（伪足但没有变平）；1/2，散布树突状（扁平伪足）；3/4，散布（晚期伪足，透明质散布）；1、完整展开（完整激活）。基于在 SEM 下察看到的约 50 个粘附血小板计算血小板活化的平均水平。经过将粘附的血小板数量乘以平均活化水平来定义规范化的活化血小板数量。显现的值是来自典型实验（即一个供体）的至少三个计数的平均值。

2.6. 内皮细胞粘附和增殖

在弥补有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 抗生素的培育基 199 (Gibco) 中培育人脐静脉内皮细胞 (HUVEC, ECV 304)。依照 Ford 等人的计划，从犬颈外静脉 (canine EC) 中采集原代内皮细胞。运用 BME (Gibco) 和 20% FBS 作为培育基将细胞接种在培育皿上。

运用一块圆形玻璃盖玻片（直径 15 毫米，Matsunami，日本）作为对照。盖玻片上的聚氨酯样品用 70% 酒精消毒，并用 PBS 彻底冲洗。将它们放入 24 孔组织培育板的孔底。将细胞浓度约为 5×104 ml 的细胞悬浮液 (1 ml) 添加到每个孔中。内皮细胞在 5% CO2/95% 空气下于 37°C 下孵育 HUVEC 最多 96 小时，犬 EC 最多 48 小时。

为了在培育期终了时对样品上的粘附细胞（每个名义积为 1.76 cm）中止计数，从培育板中取出培育基。用 1ml PBS 冲洗样品。然后经过胰蛋白酶-EDTA消化处置5分钟使细胞分别。经过添加培育基中止胰蛋白酶化。经过离心搜集细胞，重新悬浮并经过血细胞计数器分离倒置相差显微镜（Nikon TE-300，Japan）计数。值是至少三个计数的平均值。

2.7. 统计剖析

在每个实验中搜集多个样本（n = 3-6）并表示为平均值±规范倾向。ANOVA 措施用于评价结果的统计学意义。小于 0.05 的 P 值被以为是显着的。

2.8. 大鼠皮下植入体内生物稳定性和体外降解实验

将聚氨酯样品切成1cm×1cm，70%乙醇灭菌，冲洗洁净后置于PBS中。8周Wistar大鼠用2.5mg/100g戊巴比妥麻醉。老鼠背上的皮毛被当心肠夹在脊椎两侧（~3 cm×3 cm）。用 70% 乙醇清洁这些区域。在每一侧，用手术刀切开一个约 1.5 cm × 1.5 cm 的切口。然后将样品插入皮下部位，每侧一个。用Polysorb缝合线缝合皮肤伤口。3（自动缝合，美国）。三个月后，将大鼠麻醉并取出植入的样品，用Triton认真清洗，单调并经过ESCA剖析，或涂敷用于名义生物降解的SEM察看。

关于体外氧化降解实验，运用 10% H2O2 和 0.05 M CoCl2 作为加速模仿环境。样品在 37°C 下浸泡 2 周。每三天改换一次溶液。处置后，取出样品并在蒸馏水中彻底冲洗。经过ESCA和反射光学显微镜（Nikon Labophot，Japan）剖析名义降解。

三、结果

表 2 列出了样品的分子量、Tg 和拉伸性能。PCUJ2和PCUJ1系列具有更好的机械强度。PCUA2系列具有更好的伸长率和更大的柔韧性。依据 Tg 值的规律（即相混合使 Tg 升高），在同一系列内，随着软链段含量的增加，微相分别增加。充沛的相分别能够进步模量，因而同系列聚氨酯的模量并不总是随着软链段含量的增加而降低。

表 2：分子量、Tg 和机械性能

表 3 显现聚合物的水接触角落在一个相当窄的范围内（72-82°）。薄膜的亲水性大致为PCUA2系列> PCUJ1系列> PCUA1系列> PCUJ2系列。总体而言，软链段含量越大，亲水性越大。表4中，名义元素散布表明，PCUA2系列中更多的氧原子（较大的O/C比）裸露在名义，其次是PCUA1系列。C-O/C-C 比在 0.28-0.41 范围内，PCUA2 系列更大。这表明更多的软段迁移到 PCUA2 系列中的样品名义。

表3：薄膜与水的接触角

表4：ESCA 丈量的流延膜名义元素

PCUA2 系列和两种市售聚氨酯的平均名义粗糙度由它们的 AFM 图像计算得出。Chronoflex C 的值分别为 0.51 nm、Pellethane 的 1.88 nm、PCU211A2 的 0.46 nm、PCU321A2 的 0.48 nm 和 PCU431A2 的 19.05 nm。依据这些值，除 PCU431A2 外，名义十分平整和润滑。名义域结构只能在 PCU431A2 上可视化，如图 2 所示，表明该样品中存在较大的微相分别。为了比较，Chronoflex C 的相当平整的名义也包含在图中。

图 2. AFM 图像显现 PCU431A2 的畴结构和 Chronoflex C 相对平整的名义

如表 5 所示，PCUA2 系列的纤维蛋白原吸附与白蛋白吸附的相对量最低。从该表和图 3 能够看出，在 PCUA2 和 PCUJ2 系列中，纤维蛋白原/白蛋白吸附比随着 Tg 的降低（即软链段含量的增加）而降低。另一方面，PCUA1系列和PCUJ1系列的比例坚持相似。总体而言，PCU431A2 和 PCU321A2 的纤维蛋白原/白蛋白吸附比最小，其次是 PCU431J2。

表 5：聚氨酯样品名义的蛋白质吸附

图 3. Tg 与蛋白质吸附的关系。

如表 6 所示，除 Chronoflex C、PCU431A2 和 PCU431J2 外，测试样品的血小板粘附数无显着差别。PCU321A2 和 PCU431A2 上的血小板活化较少。PCUA2和PCUJ2系列的血小板活化随着软段含量的增加而降低，而PCUA1和PCUJ1系列的血小板活化不明显。总体而言，PCU431A2 的血小板粘附和活化最少，其次是 PCU321A2 和 Chronoflex C，然后是 PCU431J2。

表 6 血小板在不同基材上的粘附和活化

表 7 分别显现了 HUVEC 和犬 EC 在不同聚氨酯上的细胞附着（12 小时）和增殖（48 小时及以后）。在 PCU431A2、PCU431J2、PCU321J2 和 PCU431J1 上察看到最大的 HUVEC 附着。但是，在 PCU431A2、PCU431J2 和 PCU321A2 上留意到 HUVEC 的增殖。在每个系列中，总是在软段含量最高的样品（即 PCU431）上发现最多的细胞。关于犬 EC，在 PCU431A2 和 Chronoflex C 上察看到最大的附着和生长，其次是 PCU321A2。

表 7 样品名义的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和犬颈静脉内皮细胞（canine EC）的数量（面积1.76 cm2）

如图 4 所示，在大鼠皮下植入 3 个月后，在 Pellethane 上很容易察看到名义裂纹，但在任何 PCU 上都没有。在图 5 中，经过 2 周的体外氧化处置后，一切聚氨酯上都能够看到名义麻点和起皱。PCU431J2 似乎是最稳定的。经过表8所示的ESCA剖析，不同系列之间植入或治疗后O/C的变更是不规则的。PCU431A2 和 PCU431A1 的 C-O/C-C 比降低，但在 PCU431J2 和 PCU431J1 在体内或体外过程后增加，表明在此过程中前两者发作断链，后两者发作氧化。以 C-O/C-C 比值的体内变更作为稳定性指标，PCU431J2 的生物稳定性最好，其次是 PCU431J1、PCU431A2，然后是 PCU431A1。Chronoflex C 的生物稳定性与 PCU431A2 相似。

图 4. 大鼠体内皮下植入 3 个月前后的样品名义扫描电子显微照片。

图 5. 2 周体外加速氧化处置前后样品名义的光学显微镜照片。

表8 PU膜在体内和体外生物稳定性实验后的名义变更

四、讨论

由于每个系列都有不同的软段，因而不太可能依据 Tg 值比较四个系列之间的相分别。但是，关于PCUA2、PCUA1、PCUJ2和PCUJ1系列，微相分别（以Tg判别）均随着各系列软段含量的增加而增加。这种微相分别的增加在具有较大 MW（~2000）的软段中最为明显，即 PCUA2 和 PCUJ2 系列，其中 PCU211 和 PCU431 之间的 Tg 差别可能接近 30°。PCUJ1系列的微相分别变更最小，PCU211J1和PCU431J1之间的Tg差别仅为8°。Tg 随软链段含量的最大变更发作在 PCU321A2（比 PCU211A2 低 24°）和 PCU431J2（比 PCU321J2 低 21°），固然软链段相对丰厚，但仍察看到抗拉强度增加。在具有较大 MW (~2000) 的软链段中察看到的较大微相分别与 SAXS 充沛记载的发现分歧，即较长软链段长度带来的结晶促进了更完好的微相分别。

聚合物名义的水接触角十分相似，但仍察看到亲水性趋向。PCU321A2 和 PCU431A2 是一切配方中亲水性最强的，其次是 PCU431A1。ESCA 剖析还显现其名义的氧含量较高，这可能是亲水性的缘由。这种富氧也可能表明微相分别更大 PCUA2 系列相关于其他系列，由于 PCUA2 中更多的软段迁移到样品名义。

有趣的是，关于 PCUA2 系列，纤维蛋白原吸附与白蛋白吸附的相对量也是最低的，表明白蛋白优先吸附在这些微相分别的名义上。当在一个系列（即前面提到的 PCUA2 和 PCUJ2 系列）中，随着软链段的增加，微相分别的增加（即 Tg 的降落）是明显的，纤维蛋白原/白蛋白的吸附比也随之降落。但是，当 微相分别变更很小，与PCUJ1系列一样，纤维蛋白原/白蛋白吸附比坚持相似。这些倡议的微相分别在名义蛋白吸附中发挥作用，这与 Huang 等人以及 Grasel 和 Cooper 报道的分歧。

聚氨酯名义上的血小板活化也与上述察看分歧。在PCUA2和PCUJ2系列中，随着软节段的增加，平均血小板活化水平降低更为显着。血小板活化最少的样本是 PCU431A2 和 PCU321A2，其次是 PCU 431J2。正如文献中所提出的，这种血液相容性的结果能够从它们的低名义纤维蛋白原/白蛋白吸附比和更大的微相分别中圆满地预测出来。固然据报道聚碳酸酯聚氨酯比聚醚聚氨酯具有更好的血液相容性，但我们发现聚碳酸酯聚氨酯并不总是具有低血小板粘附和活化。在我们的研讨中，PCUA1 和 PCUJ1 系列的血小板粘附和活化与传统的聚醚聚氨酯相似。

曾经提到名义的氧含量（O / C，C-O / C-C）与内皮细胞生长相关。PCU431A2、PCU321A2和PCU431A1在一切样品中名义的氧散布较多，这也与本研讨中犬EC的数量有关。早期在 PCU431J2、PCU321J2 和 PCU431J 上察看到的良好 HUVEC 附着可能是据报道与细胞激烈相互作用的芳香结构的结果。或者，这可能是由于微相分别。由于微相域（5-25 nm）的尺度与血浆、组织或细胞蛋白的大小相似，微相域和蛋白质之间可能发作生物信号转导。这些信号能够传送到小区中。Dalby 等人察看到成纤维细胞与 27 nm 高分子分层纳米形貌的快速粘附。此外，他们还报道了 13 nm 高分子分层纳米岛对基因的普遍上调。我们的细胞数据表明 PCU431 在每个系列中具有更好的细胞亲和力，也能够解释为内皮细胞对微相分别结构的纳米特征（~5-25 nm）的粘附增加。Soldani 等人经过 Chronoflex 的 AFM 数字图像演示了基本平整的微观几何外形。我们还察看到 Chronoflex C 的平均名义粗糙度十分小（~0.51 nm）。但是，我们以为具有最大微相分别的 PCU431A2 样品名义上的域结构能够经过 AFM 可视化，其中 z 粗糙度约为 20 nm，最小暗点和亮点（在 xy 平面上）的域尺寸近似小于 50 nm（图 2）。可能由于分辨率的限制，在任何其他样品上都不容易看到这种纳米特征。

大鼠皮下植入 3 个月后，与 Pellethane 对照相比，一切 PCU 都表示出不同寻常的生物稳定性，这与许多先前的研讨十分分歧。PCU431A2 和 PCU431A1 中的 C-O/C-C 比率降低，但在体内或体外处置后 PCU431J2 和 PCU431J1 增加。我们以为增加表示氧化，减少表示经过碳酸酯键发作氧化和水解断链。理论上，近芳烃结构的碳酸酯不易发作断链。这解释了在 PCUJ2 中察看到的不相上下的生物稳定性。依据数据，微相分别的 PCUA2 比 PCUA1 更具生物稳定性。PCUJ2 也比分别度较低的 PCUJ1 更稳定。更大的生物稳定性可能归因于在增加微相分别水平时更大水平的氢键。

总体而言，PCU431A2 和 PCU321A2 是最受欢送的配方，具有更高的生物相容性和生物定性。我们以为这种更好的性能与适合的微相分别密切相关。如前所述，曾经指出聚氨酯名义适合的相分别可能招致最低的纤维蛋白原/白蛋白吸附比和血小板活化。在我们的研讨中，每个 PCU 上的优先白蛋白吸附与较低的血小板活化十分分歧。他们。应该留意的是，低纤维蛋白原/白蛋白吸附比对生物相容性的益处可能不适用于整个系列。例如，Chronoflex C 的纤维蛋白原/白蛋白比率高于 PCU431A2 和 PCU321A2。但是，它的血液相容性和细胞亲和力与这两者相似。除此之外，就整个研讨而言，影响蛋白质吸附的微相分别结构似乎是决议四个系列聚碳酸酯基聚氨酯生物相容性的关键要素。

五、结论

经过运用四种不同的软链段，两种脂肪族大分子二醇（聚（己基，乙基）碳酸酯二醇，MW 分别为 2017 和 865）和两种芳香族大分子二醇（MW 2000 和 1000）合成了一系列基于 MDI 的聚碳酸酯基聚氨酯 , 分别), 与 MDI 的摩尔比不同。微相分别会影响蛋白质的吸附、血小板的活化以及细胞的附着和生长。更长的大分子二醇招致更多的相分别结构。芳香族大分子二醇具有更好的机械强度和生物稳定性。总体而言，运用 MW 2017 的聚（己基，乙基）碳酸酯二醇以 3/2/1 或 4/3/1 的摩尔比 MDI/大分子二醇/扩链剂合成的聚氨酯产生了更大的微相分别以及优秀的 生物相容性和生物稳定性。

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