蛋白质含量测定措施引见

Bradford 措施1976年由Bradford树立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是依据蛋白质与染料相分离的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超越其他几种措施的突出优点，因而正在得到普遍的应用。这一措施是目前灵活度最高的蛋白质测定法。

一、原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质分离，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研讨以为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相分离，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是:(1)灵活度高，据估量比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检丈量可达1mg。这是由于蛋白质与染料分离后产生的颜色变更很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变更比Lowry法要大的多。(2)测定快速、烦琐，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需求5分钟左右。由于染料与蛋白质分离的过程，大约只需2分钟即可完成，其颜色能够在1小时内坚持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完整不用像Lowry法那样费时和严厉地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺陷是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因而Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的倾向，在制造规范曲线时通常选用球蛋白为规范蛋白质，以减少这方面的倾向。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(好像0.1N的酸干扰Lowary法一样)。(3)规范曲线也有细微的非线性，因而不能用Beer定律中止计算，而只能用规范曲线来测定未知蛋白质的浓度。

二、试剂与器材1.试剂:(1)规范蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的规范蛋白质溶液。(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再参与120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2.器材:(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支

三、操作措施1.规范措施(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其他试管分为两组按表中次第，分别参与样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的规范蛋白质溶液给各试管分别参与:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水弥补到0.1ml。最后各试管中分别参与5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立刻在旋涡混合器上混合(留意不要太猛烈，以免产生大量气泡而难于消弭)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。(2)加完试剂2~5分钟后，即可开端用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250试剂。留意:不可运用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，运用后立刻用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。(3)用规范蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条规范曲线。由此规范曲线，依据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2.微量法当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)，可将取样量(包含补加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml，同时作相应的规范曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

Folin—酚试剂法（Lowry法）

一、实验原理这种蛋白质测定法是最灵活的措施之一。过去此法是应用最普遍的一种措施，由于其试剂乙的配制较为艰难（往常已能够订购），近年来逐步被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲措施是相同的，只是参与了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而进步了检测蛋白质的灵活度。这两种显色反响产生深兰色的缘由是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜分离生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基恢复，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry肯定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学范畴得到普遍的应用。这个测定法的优点是灵活度高，比双缩脲法灵活得多，缺陷是费时间较长，要精确控制操作时间，规范曲线也不是严厉的直线方式，且专注性较差，干扰物质较多。对双缩脲反响发作干扰的离子，同样容易干扰Lowry反响。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须进步碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。中止测定时，加Folin—酚试剂时要特别当心，由于该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述恢复反响只在pH=10的状况下发作，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立刻混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，恢复反响即能发作。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

二、试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次运用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，参与100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充沛混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流终了时，参与150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，启齿继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。运用时用规范NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后恰当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）规范蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2.器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支三、操作措施1.规范曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其他试管分红两组，分别参与0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升规范蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管参与5毫升试剂甲，在旋涡混合器上疾速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管参与0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立刻混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色水平削弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出规范曲线。留意：因Lowry反响的显色随时间不时加深，因而各项操作必须精确控制时间，即第1支试管参与5毫升试剂甲后，开端计时，1分钟后，第2支试管参与5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超越10分钟，则第1支试管可立刻参与0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管参与0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开端测定光吸收。每分钟测一个样品。中止多试管操作时，为了避免出错，必须在实验记载本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要参与的量（毫升），并按由左至右，由上至下的次第，逐管参与。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述措施中止操作，取1毫升蒸馏水替代样品作为空白对照。通常样品的测定也可与规范曲线的测定放在一同，同时中止。即在规范曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。依据所测样品的吸光度值，在规范曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。留意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅常常随不同的蛋白质而变更。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相关于规范蛋白质）。

二喹啉甲酸法(BCA法)

一、实验原理BCA检测法是Lowry测定法的一种改进措施。与Lowry措施相比，BCA法的操作更简单，试剂愈加稳定，简直没有干扰物质的影响，灵活度更高（微量检测可抵达0.5μg/ml），应用愈加灵活。 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+恢复成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，能够和Cu+分离生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的措施肯定蛋白质的含量。

二、实验资料 1.实验器材 721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。 2.实验试剂 (1) BCA试剂的配制 ① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调理pH值至11.25。 ② 试剂B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。 ③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合平均。此试剂可稳定一周。 (2)规范蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。 (3)样品溶液：配限制50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。

三、实验操作

1.绘制规范曲线 规范曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作：

试 剂

管 号

1

2

3

4

5

空白管

测定管

蛋白质规范液（ul）（1.5mg/ml）

20

40

60

80

100

双蒸水（ul）

80

60

40

20

0

100

待测样品（ul）

100

BCA工作液（ml）

2

2

2

2

2

2

2

混匀，37℃保温30min，用562nm比色，测定吸光度值

2．实验结果 依据样品的吸光值从规范曲线上查出样品的蛋白质含量。

四、该措施的优点

(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且愈加方便；

(二) 精确灵活，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。

(三) 经济适用，除试管外，测定可在微板孔中就中止，大大节约样品和试剂用量；

(四) 抗试剂干扰才干比较强，如去垢剂，尿素等均无影响 。