基于HPLC-Q-TOF-MS及化学方式辨认措施对陈皮的化学成分 ...

陈皮Citri Reticulatae Pericarpium为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的单调成熟果皮。陈皮效果考证是以橘柚之名始载于《神农本草经》[1]，又名橘皮、红皮、柑皮等。陈皮在广西、福建、贵州、湖南、江西、四川、重庆、云南都有消费[2]。有普遍的临床用处，具有调理胃肠平滑肌运动，控制消化液分泌、利胆保肝、祛痰平喘、松弛子宫平滑肌等多种药理作用[3]，在《中国药典》2020年版收载的1606个成方药剂中，含陈皮的就有197个，可见其应用的重要和普遍。

陈皮药材中以“广陈皮”的质量为优，“广陈皮”中又以新会陈皮为道地药材[4]，在临床应用与药效功用方面与其他陈皮有显著差别[5]，其市场价钱也远高于普通陈皮。但是产量有限，容易构成市场供不应求，因而有不少商家应用陈皮在外观上的相似性，以次充好、以假乱真，严重损伤了消费者的利益。目前，关于陈皮产地的鉴别主要还是阅历鉴别，是靠阅历丰厚的工作人员依据颜色、外形、气息等差别对不同陈皮中止鉴别，容易受客观条件及客观环境要素的影响，精确度很难把控。《中国药典》2020年版把陈皮药材分为“陈皮”和“广陈皮”，陈皮以橙皮苷作为质量评价指标，广陈皮以橙皮苷、川陈皮素和橘皮素3个成分作为质量评价指标，但其他产地的陈皮中川陈皮素和橘皮素的含量也不低[2]，应用单一成分显然不能精确评价药材质量。

中药产地鉴别是道地药材质量研讨的重要方向。多元统计剖析措施的应用以及主成分剖析与偏最小二乘法-判别剖析的化学方式辨认措施已被普遍应用于不同产地中药材特征化学成分的剖析[6]。分离判别剖析措施可对未知产地中药材中止产地判别[7-8]。胡继藤等[9]采用GC-MS分离化学计量学措施鉴别不同产地不同种源陈皮。但是，陈皮的主要化学成分为黄酮、柠檬苦素及生物碱等难挥发性化合物[10]。童超英等[11]采用在线提取-高效液相色谱-二极管阵列-四极杆飞行时间质谱法提取和分别审定陈皮中24种黄酮类化合物。张珂等[12]用UHPLC-IT-TOF-MS从陈皮提取物中初步审定了61个化学成分。因而，应用液相色谱-高分辨质谱技术分离多元统计剖析措施能更好地完成陈皮产地的鉴别。

本研讨采用高效液相色谱-高分辨质谱法审定了新会、广西和湖南不同产地陈皮中的难挥发性化学成分，并分离多元统计剖析措施中止剖析，找出新会陈皮与其他陈皮之间的差别成分。针对这些成分树立模型，对未知来源陈皮产地中止判别剖析，推测其产地来源的真实性。本实验所树立的措施可用于判定陈皮的掺假现象，有效的保障陈皮产地的真实性。同时，为陈皮质量规范研讨提供了支持。

1 资料与仪器

1.1资料

所搜集的36批次原产地药材中，产自新会的标记为XH1～12（编号S1～S12）；产自广西的标识为GX1～12（编号S13～S24）；产自湖南的标识为HN1～12（编号S25～S36）。另外18批来自民间珍藏的宣称新会陈皮。以“XC”标记为XC1～18（编号S37～S54）。经广东药科大学肖雪教授审定为芸香科植物橘C. reticμlataBlanco及其栽培变种的单调成熟果皮。

橙皮苷（批号110721-201818，质量分数≥96.2%）、新橙皮苷（批号111829-201703，质量分数≥99.5%）、柠檬苦素（批号111699-200501，质量分数≥98.5%）、川陈皮素（批号110878-201602，质量分数≥99.7%）和橘皮素（批号110722-201106，质量分数≥99%），柚皮苷（批号110722-201105，质量分数≥99%），均购自中国食品药品检定研讨院。辛弗林（批号JS90035，质量分数≥98%），购自上海金穗生物科技有限公司。水为二次蒸馏水，甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯试剂（德国Merck公司），甲酸和乙酸铵（阿拉丁试剂）。

1.2 仪器

Agilent1290 HPLC-6540-Q-TOF-MS配有双放射流电喷雾离子源（美国安捷伦公司）配置Aglient自带数据处置软件；KQ2200型台式机械超声波清洗器（东莞市超声波设备有限公司），赛多利斯TP-114电子天平（美国Sartorious公司）。

2措施

2.1 供试品溶液的制备

陈皮样品经粉碎，过50目筛，取样1.0 g（精确至1.0 mg），置于25 mL具塞试管中，参与70%甲醇溶液25 mL，中间振摇3次，超声处置40 min，取出放冷至室温，定容至25 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称辛弗林、新橙皮苷、橙皮苷、柠檬苦素、柚皮苷、川陈皮素和桔皮素共7种对照品各5.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别得到对照品贮藏液；用70%的甲醇溶液稀释得到10 mg/L的混合对照品溶液。

2.3 液相色谱条件

色谱柱：Aglient Poroshell 120 SB C 18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm），活动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，100% B；5～12 min，0～25% A；12～20 min，25%～35% A；20～30 min，35%～45% A；30～40 min，45%～55% A；40～45 min：55%～65% A；45～50 min，65%～100% A；50～52 min，100% A；53～60 min，100% B。体积流量0.3 mL/min；柱温为30 ℃，进样量为5 μL。

2.4质谱条件

离子源为Agilent双喷Jet Stream源（Dual Jet Stream ESI），正离子方式采集，单调气（N 2 ）温度350 ℃，雾化气（N 2 ）压力276 kPa，单调气（N 2 ）温度325 ℃，体积流量8 L/min，鞘气温度350 ℃，体积流量11 L/min，毛细管电压3000 V，毛细管出口电压（Fragmentor）110 V，锥孔电压（skimmer）65 V， 八极杆电压750 V，采集方式为Auto MS/MS，扫描范围m/ z 70 ～1100；参比离子正离子为m/ z 121.050 9 、922.009 8。

2.5数据处置

样品经液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱测定，正离子自动二级方式采集数据，得到一级及自动二级总离子流色谱图，依据图中每个峰的精确质量数及同位素散布推测分子式，分离二级质谱及文献资料审定出化学成分，并采用对照品中止考证。分离主成分剖析（principal component analysis，PCA） 、偏最小二乘法判别剖析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）、聚类剖析及判别剖析，研讨不同产地陈皮的分类及判别措施。

3结果与剖析

3.1陈皮化学成分的审定

按“2.3”“2.4”项中的措施，分别在正、负离子方式下采集数据。结果显现在负离子方式得到的总离子流图色谱图峰数目很少，正离子方式下得到总离子色谱图峰数目多且丰度高，各峰分别理想。可见正离子方式得到的数据更有代表性，因而重点研讨正离子方式下色谱峰的化学成分信息。将总离子流色谱图中各个峰（图1），推测其可能的分子式。再依据其二级质谱图，研讨其可能的质谱裂解规律，分离参考文献及Chemspider、PubChem等数据库，推断化合物的可能结构式，审定其化学成分。最终审定出29个主要化学成分，结果见表1。

从审定出的化学成分中发现，陈皮的主要成分为多甲氧基黄酮类，其主要裂解过程为其母核脱去甲氧基或中性丧失水分子的过程，以下20号峰为例，准分子离子峰[M＋H] +的精确质量数为403.138 5，推断其分子式为C 21H 22O 8，二级碎片离 子（图2-A），主要有373.091 8、388.115 0、355.080 9、327.085 8等，质谱裂解规律为准分子离子峰m/z 403.138 5中性丧失1个甲氧基，构成m/z 373.091 8[M＋H－OCH 3 ] +碎片离子，再丧失1分子水，构成m/z355.091 8 [M＋H－OCH 3 －H 2 O] +碎片离子，该离子继续失去2个甲基，得到m/z 327.085 8 [M＋H－OCH 3 －H 2 O －2CH 3 ] +碎片离子；准分子离子峰m/z 403.138 5失去一个甲基，构成m/z388.115 3 [M＋H－CH 3 ] +的碎片离子，分离文献报道，推断20号峰为川陈皮素或其同分异构体。经过对照品考证为川陈皮素。其质谱裂解机制如图2-B所示，从总离子流图中还可见另外2个15号和25号峰的精确质量数与此峰相同，其相同碎裂电压下的二级碎片离子相同丰度不同，可推测为川陈皮素的同分异构体，均属于六甲氧基黄酮。

图3中9号峰准分子离子峰[M＋H] +的精确质量数为725.228 7，推断其分子式为C 33H 40O 18，二级碎片离子，主要有419.133 1、389.085 5、349.890 3，质谱裂解规律为准分子离子峰m/z 725.228 7失去一个葡萄糖基和3-羟基-3-甲基戊二酸基团，构成m/z 419.133 1[M＋H－162－146] +的碎片离子，然后 再进一步丧失2个甲基，构成m/z 389.085 5[M+H－162－146－30.0467] +的碎片离子，分离文献信息可推测该化合物为柚皮黄素-3- O -(3- 羟基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷。

陈皮大部分化学成分为多甲氧基黄酮类，其相对含量占95.8%（表1）。研讨表明，多甲氧基黄酮具有多种生物活性，如抗炎、抗癌、抗动脉粥样硬化、调血脂、降血糖、维护记忆等[13]，羟基化的多甲氧基黄酮具有比多甲氧基黄酮更好的溶解性和渗透性[14]。黄酮苷类化合物是陈皮中另一种主要的黄酮类化合物，如橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等。其二级质谱中的碎片离子多表示为[M＋H－162] +和[M＋H－146] +，或[M＋H－162－146] +，为分子离子分别脱去葡萄糖基或鼠李糖基的过程。 目前，《中国药典》中陈皮以橙皮苷作为质量评价指标，广陈皮以橙皮苷、川陈皮素和桔皮素3个成分作为质量评价指标。但是，陈皮药效为其一切多甲氧基黄酮及黄酮苷共同发挥作用[15]，仅以1～3个化合物作为评价指标不能真正反映药材质量。需求制定多个多甲氧基黄酮及黄酮苷共同定量剖析的质量评价措施。

3.2不同产地陈皮差别成分剖析

3.2.1PCA PCA 是一种无监视的降维数据处置措施，能够真实的反映原始数据的分组状况。本研讨采用SIMCA 14.1软件，以采集的36批次陈皮样品数据为数据矩阵，对3个不同产地的陈皮数据中止主成分剖析，结果见图4-A。质控样本较集中，表明采集措施稳定牢靠；新会陈皮散布集中，聚为一类，与湖南、广西的陈皮分辨明显；湖南陈皮和广西陈皮聚为一类，但湖南陈皮散布较集中，差别性较小；广西陈皮分散大，差别大。

3.2.2OPLS-DAOPLS-DA 表明新会陈皮可与湖南陈皮和广西陈皮明显分辨，存在组间差别，为更好地察看组间差别，本研讨采用有监视的OPLS-DA剖析措施，选择新会陈皮与湖南陈皮和广西陈皮的差别性化学成分。由OPLS-DA结果可知，新会陈皮可明显分辨其他2产区的陈皮（图4-B），且R2X（cum）＝0.821，R2Y（cum）＝0.984，Q2（cum）＝0.963，表明模型的解释度和预测度良好。采用变量重要性投影值（VIP）大于1，且coefficients plot中置信区间不外原点，并分离t检验（P＜0.05）结果，选择新会陈皮与其他2个产地陈皮的化学成分。从当选择出18个成分，见图4-C所示，并审定了其中9个差别成分，包含甜橙黄酮、辛弗林、羟基-四甲氧基黄酮、柚皮苷、枸橘苷、柠檬苦素、橘皮素、六甲氧基黄酮、羟基六甲氧基黄酮。这些成分在分辨不同产地陈皮药材间起到重要作用，可作为陈皮道地药材的指标成分（图4-B）。

3.2.3聚类剖析以相对含量较高的川陈皮素为参照，各差别成分的色谱峰相关于参照峰的相对峰面积为变量，组成36×12阶原始数据矩阵。采用IBM SPSS 20.0软件中止聚类剖析，聚类措施采用组间衔接法，测区间为Euclidean距离，数据无规范化，得到样品平均链接（组间）的谱系图（图5）。结果表明，在欧式距离为10时，36批药材样品可聚为3类，XH1～XH12聚为一类，GX3、GX4和GX6 聚为一类，HN1～HN12、GX1、GX2、GX5、GX7～GX12聚为一类，可见采用聚类剖析新会陈皮分类效果显著，而广西和湖南的分类不明显。这与PCA剖析和OPLS-DA剖析结果分歧。

3.2.4产地判别剖析以川陈皮素为参照，各差别峰相关于参照峰的相对峰面积为变量，采用IBM SPSS 20.0软件对上述原始数据矩阵中止判别剖析。选择Fisher、未规范化为函数系数参数，先验概率选择依据组大小计算。36批陈皮样品典型判别函数1和典型判别函数2的得分作散点图如图6所示，图中显现湖南、广西和广东新会陈皮明显聚为3类。其中，新会陈皮与广西和湖南陈皮区别明显，与前面结果分歧。采用判别剖析考证3个产地判别的精确性，初始考证中36个陈皮样品全部被正确归类，总体正确率为100%；交叉考证中2个广西陈皮样品被归为新会，其他34个样品按产地被正确归类，交叉考证总体正确率为94.4%，措施的精确度较好。

3.2.5陈皮产地鉴别措施适用性考证采用“3.2.4”项树立的判别函数，对18个来自民间珍藏的新会陈皮样品中止独立样本测试，结果如表2所示，18个样品中17个判定为新会陈皮，精确度为94.4%，其中一个判定为湖南陈皮。

4 讨论

本研讨调查了不同提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇和纯甲醇）和不同超声提取时间（30、40、50 min）对陈皮提取成分的影响，结果显现，70%甲醇提取液总离子流图的色谱峰较多，基线噪音较低，不同超声时间无明显差别，因而选择70%甲醇超声提取40 min做为提取措施。

为了分别陈皮中所含的多种黄酮类物质及黄酮类同分异构体，研讨对比了3种不同色谱柱（Agilent Poroshell 120 EC-C 18 （100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；Agilent Poroshell 120 PFP （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；Aglient Poroshell 120 SB C 18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm），结果显现采用Aglient Poroshell 120 SB C 18色谱柱分别理想，更有利于多羟基化合物的分别。

本研讨采用HPLC-Q-TOF-MS剖析了不同产地陈皮中的难挥发性化学成分，从中审定出了29个主要化学成分，主要包含多甲氧基黄酮及黄酮苷2类化合物。PCA、OPLS-DA剖析与聚类剖析结果表明，广西与湖南陈皮化学成分差别不明显，但与新会陈皮存在显著差别。甜橙黄酮、辛弗林、羟基-四甲氧基黄酮、柚皮苷、枸橘苷、柠檬苦素、橘皮素、六甲氧基黄酮、羟基六甲氧基黄酮等成分可作为新会陈皮的道地药材与其他产地的差别标记性成分。应用差别成分树立的新会陈皮产地鉴别模型可准的确现新会陈皮的鉴别，精确度大于94.4%。

利益抵触一切作者均声明不存在利益抵触

参考文献（略）

来 源：黄 芳，周 熙，罗辉泰，谢淑桐，张春华，谢梦婷，邓 欣，吴惠勤．基于HPLC-Q-TOF-MS及化学方式辨认措施对陈皮的化学成分快速鉴别及产地判别研讨 [J]. 中草药, 2022, 53(20): 6361-6368 .