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图1. 经过WB检测经典Yamanaka因子评价胚胎干细胞的分化[1] （2） 对基因的功用缺失研讨 经过敲减或过表白目的基因后，用WB 技术检测相关通路蛋白的表白变更，以肯定目的基因激活或抑止目的蛋白的表白调控关系，探求信号通路。
图2. WB证明敲减EZH2上调p21蛋白表白[2] （3） 研讨目的蛋白所处的细胞定位 蛋白的分选投递与发挥功用是基因调控的结果，因而改动了某些基因的活性，或化学修饰可能会影响其效应蛋白的转运，改动细胞核质中的散布，引发不同的生物学效应。
图3.经过WB检测目的蛋白LIN28A在细胞核质中的散布[3] （4） 药物处置、代谢类的研讨
图4.研讨药物处置时间或计量的不同对效应蛋白的研讨[4] （5） 蛋白相互作用类研讨 经过WB可检测Co-IP、RIP、CHIRP等实验的IP产物，研讨目的蛋白-蛋白，RNA-蛋白之间的相互作用。
图5. 不同的Trp53等位基因不成水平的与效应蛋白MDM2相互作用[5] 实验流程：
一、 试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验; 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml; 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml; 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml; 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中; 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μL。 二、 蛋白样品制备 贴壁细胞样品 1. 倒掉培育液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培育液; 2. 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放悄然摇动1 min洗濯细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培育液。将PBS弃净后把培育瓶置于冰上; 3. 按1ml裂解液加10 μL PMSF（100 mM），摇匀置于冰上; 4. 每瓶细胞加400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充沛裂解培育瓶要经常来回摇动; 5. 裂解完后，用洁净的刮棒将细胞刮于培育瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中; 6. 于4℃下12000 rpm离心5 min; 7. 将离心后的上清分装转移到0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。 组织总蛋白的提取 1. 将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用洁净的剪刀将组织块尽量剪碎; 2. 加400 uL单去污剂裂解液裂（含PMSF或蛋白酶抑止剂）于匀浆器中，中止匀浆。然后置于冰上; 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎; 4. 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。 三、 蛋白定量 依据蛋白定量试剂盒（通常运用BCA法），对样品中总蛋白浓度中止定量。 四、 SDS－PAGE电泳 1. 将样品参与等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE剖析; 2. 电泳:在电泳槽中参与1×电泳缓冲液，衔接电源，电泳时，积层胶电压80V,分别胶电压150V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端中止（约需2hr）。 五、 转膜 1. 电泳终了后将胶条割至适合大小，用转膜缓冲液均衡，5min×3次 ; 2. 膜处置：预先裁好与胶条同样大小的6张滤纸和PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2min，最后在转膜缓冲液中最少均衡5min; 3. 转膜：转膜装置从下至上依次按阴极碳板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极碳板的次第放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源,恒流250mA，转移120min (细致转膜时间可依据目的蛋白分子量大小与转膜电流调整)。 六、 免疫反响： 1. 用0.01MPBST洗膜(pH7.4,0.02%吐 温20)，5min×3次; 2. 封锁：将纤维素膜置于一塑料袋中，加封锁液(5%脱脂牛奶)，室温下孵育1小时或4℃过夜; 3. 参与以1mg/ml浓度，1:1000稀释的一抗抗体，室温孵育2h或4℃过夜; 4. 用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min; 5. 同上措施准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，中止化学发光反响。 七、 化学发光，显影，定影 1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充沛接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中; 2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，；翻开X-光片夹，把X－光片放在膜上固定，打开X-光片夹，依据信号的强弱恰当调整曝光时间；曝光完成后，将X-光片，疾速浸入显影液中显影，待呈现明显条带后，即刻终止显影。显影时间普通为1～2 min（20～25℃），温渡过低时（低于16℃）需恰当延长显影时间；显影终了后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间普通为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 八、 凝胶图象剖析 将胶片中止扫描或拍照，用image J等凝胶图象处置系统剖析目的带的分子量和灰度值。 问题处置 1. 检测到蛋白条带背景较深？ (1) 可恰当增加TBST中的吐温浓度; (2) 缩短二抗孵育时间; (3) 增加牛奶封锁时间; (4) 增加洗膜次数与时间; (5) 降低抗体浓度; (6) 转膜时留意用冰盒降温; (7)改换抗体，选用特异性更好的WB抗体。 2. 检测到条带倾斜？ (1) 配PAGE胶时充沛混匀; (2)上胶时充沛等到胶体凝固再电泳; (3) 检查电泳盒中导电线能否水平; (4) 降低上样总体积体系。 3. 目的蛋白分别不充沛？ 依据检测蛋白分子量，增加分别胶浓度与电泳时间。 4. 未检测到蛋白条带？ (1) 蛋白样品制备后需求留意低温保存，避免蛋白降解; (2) 肯定上样浓度，调整上样体积; (3) 转膜时肯定电极能否正确; (4) 转膜液重复应用次数太多，甲醇挥发较多; (5) 肯定AB荧光液充沛混匀; (6) 显色液应保障时间较新,显影时增加曝光时间。 参考文献： 1.WA, W., S, B., DA, O., HA, H., GM, F., CT, F., SM, C., and RA, Y. (2018). Author Correction: Enhancer decommissioning by LSD1 during embryonic stem cell differentiation. Nature 562, E24. 3.SK, K., H, L., K, H., SC, K., Y, C., SW, P., G, B., Y, L., JK, C., TK, K., et al. (2014). SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell stem cell 15, 735-749. 4.B, W., D, L., A, K., D, L., and O, K. (2014). Ionizing radiation-inducible miR-27b suppresses leukemia proliferation via targeting cyclin A2. International journal of radiation oncology, biology, physics 90, 53-62. 5.SS, M., LJ, V., N, R., JA, S., BM, F., J, M., KT, B.-R., J, L., D, I., MM, K., et al. (2017). A p53 Super-tumor Suppressor Reveals a Tumor Suppressive p53-Ptpn14-Yap Axis in Pancreatic Cancer. Cancer cell 32, 460-473.e466. 来源：佰欧晶生物 感激您的关注，祝您科研顺利！ 1. 细胞增殖/毒性检测措施比较及CCK-8法生机测定 2. 定量PCR实验中熔解曲线不止一个主峰是什么缘由? 3. 免疫组化IHC实验阅历总结 4. SCI 文章回复信中常见问题怎样处置？ 5. GraphPadPrism 8.0体验一个月后的分享！ 6. 如何正确的获取和整理大量的实验数据？ 7. 老鼠的编号措施怎样破？ 8. 5步教你跑出漂亮的大分子western-blot图诀窍 9. 细谈流式细胞分选的原理及特性 10.Western blot 实验技术及常见问题剖析 11. 【药理可投-IF4.23-年刊1500+】例文：吴茱萸碱经过激活自噬和抑止NLRP3炎性小体减轻结肠炎的损伤 12. 详解各种外科缝合法，图文并茂 ！ 13. ELISA中常见问题及处置措施 14. 干货：WB, IHC实验问题总结与处置计划 15. 国自然技术道路图如何设计和绘制 16. NCBI，从一窍不通到略知一二 17. 以《自然》来举个例子，如何在顶级期刊上发表文章？ 18. 最新国自然资源包含最新中标标书国自然写作指导大全，免费领取 19. Matrigel 运用常见问题剖析 20. 免疫沉淀（IP）的常见问题及解答 目前100000+人已关注我们 粉丝福利领取： 本公众号后台回复： WB2021免费领取Western blot 实验细致操作步骤视频解说从入门到知晓全套资料 最好转发本文到你的朋友圈或者科研群，让更多的朋友学习到有价值的东西！ 点了“在看” 的人SCI每投必接纳 顺便点个“ 赞” ，祝您科研实验一切顺利！ |
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