名奢网 › 名表› 名表日报 › 查看内容

如何通俗地理解 2017 年诺贝尔化学奖「冷冻电镜」的原理 ...

2022-12-8 19:59| 发布者: 挖安琥| 查看: 138| 评论: 5

放大缩小

简介：2017 年诺贝尔化学奖授予 Jacques Dubochet，Joachim Frank，和 Richard Henderson，以表彰他们发明冷冻电镜。什么是冷冻电镜？它的原理是什么？本题已加入知乎圆桌 2017 诺贝尔奖巡礼，更多「诺贝尔奖」相关话题讨 ...

2017 年诺贝尔化学奖授予 Jacques Dubochet，Joachim Frank，和 Richard Henderson，以表彰他们发明冷冻电镜。什么是冷冻电镜？它的原理是什么？

本题已加入知乎圆桌 2017 诺贝尔奖巡礼，更多「诺贝尔奖」相关话题讨论欢迎关注。

路过

雷人

握手

鲜花

鸡蛋

收藏邀请

已有 5 人参与

会员评论

wanhuLee 2022-12-8 20:02 引用

2017年诺贝尔化学奖颁发给了三位物理学家，以表彰他们在结构生物学上的贡献。惊不惊喜，意不意外？

真正的诺奖级成果，11G或成最大赢(shu)家21世纪，21世纪.jpg==================================更新一下，毕竟全是调侃也不太好（首先，我丝毫不怀疑这个技术有得奖的资格，并且十分钦佩创始人的独特思路。其实，冷冻电镜得奖的一大原因可能就是最近的成功应用，CNS上面的文章就不再提了。但是，奖没发给应用这个技术的人，而是创造这个技术的人，就说明了一些问题。曾经的某个老师说过，不要去做自动设备/计算机可以替你做的重复性工作，而要去做运用人的思维才能做到的事情。毕竟，机器的efficiency不知道比人高到哪里去了。以上。
wanhuLee 2022-12-8 20:02 引用

冷冻电镜：一个发给了物理学家的诺贝尔化学奖，奖励他们帮助了生物学家｜“知识分子”特别报道原创 2017-10-04 知识分子知识分子

2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者他们对冷冻电镜技术的发展做出突出贡献获奖人简介
约阿基姆·弗兰克（Joachim Frank）德裔生物物理学家，现为哥伦比亚大学教授。他因发明单粒子冷冻电镜（cryo-electron microscopy）而闻名，此外他对细菌和真核生物的核糖体结构和功能研究做出重要贡献。弗兰克2006年入选为美国艺术与科学、美国国家科学院两院院士。2014年获得本杰明·富兰克林生命科学奖。
理查德·亨德森（Richard Henderson）苏格兰分子生物学家和生物物理学家，他是电子显微镜领域的开创者之一。1975年，他与Nigel Unwin通过电子显微镜研究膜蛋白、细菌视紫红质，并由此揭示出膜蛋白具有良好的机构，可以发生α-螺旋。近年来，亨德森将注意力集中在单粒子电子显微镜上，即用冷冻电镜确定蛋白质的原子分辨率模型。
雅克·迪波什（Jacques Dubochet）Jacques Dubochet, 1942年生于瑞士，1973年博士毕业于日内瓦大学和瑞士巴塞尔大学，瑞士洛桑大学生物物理学荣誉教授。Dubochet 博士领导的小组开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品，随着冷台技术的开发，冷冻电镜技术正式推广开来。
事实上，早在2015年《自然》杂志旗下子刊Nature Methods将冷冻电镜技术（cryo-EM）评为年度最受关注的技术，我们邀请了剑桥大学MRC分子生物学实验室博士后张凯系统介绍冷冻电镜发展，同时也对在这一领域做得非常出色的华人科学家程亦凡教授进行了专访。
此次冷冻电镜技术获得诺贝尔化学奖实至名归。如下为北京生命科学研究所研究员何万中的点评。
冷冻电镜技术为何摘得2017年的诺贝尔化学奖
撰文 | 何万中（北京生命科学研究所研究员）

● ● ●
2013年，冷冻电镜技术的突破给结构生物学领域带来了一场完美的风暴，迅速席卷了结构生物学领域，传统X射线、传统晶体学长期无法解决的许多重要大型复合体及膜蛋白的原子分辨率结构，一个个被迅速解决，纷纷强势占领顶级期刊和各大媒体版面，比如程亦凡博士、施一公博士、杨茂君博士、柳正峰博士所解析的原子分辨率重要复合体结构，震惊世界。
这场冷冻电镜革命的特点是：不需要结晶且需要样品量极少，即可迅速解析大型蛋白复合体原子分辨率三维结构。这场电子显微学分辨率革命的突破有两个关键技术：直接电子相机（其中算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要贡献）和三维重构软件。
引领这些技术突破的背后离不开三位冷冻电镜领域的开拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分别在基本理论、重构算法和实验方面的早期重要贡献。
我本人与这三位科学家都有曾过面对面的交流，也是读他们的文章进入这个领域的，下面简要谈谈他们的贡献。
电子显微镜于1931年发明，但在生物学领域的应用滞后于材料科学，原因在于生物样品含水分才会稳定，而电子显微镜必须在高真空下才能工作，因此如何制作高分辨率生物电镜样品是个技术瓶颈。传统的重金属负染技术，可以让重金属包被蛋白表面，然后脱水干燥制作适合真空成像的样品，但这会导致样品分辨率降低（至多保存1.5纳米）。
1968年，英国剑桥大学MRC实验室的Klug博士和他的学生DeRosier开创了基于负染的噬菌体病毒的电镜三维重构技术（Klug 博士获1982年诺贝尔化学奖）。但如何保持生物样品原子分辨率结构又适合电镜成像呢？加州大学伯克利分校的Robert Glaeser博士和他学生Ken Taylor 于1974年首次提出并测试了冷冻含水生物样品的电镜成像，可以有效降低辐照损伤对高分辨率结构破坏和维持高真空，实现高分辨率成像的新思路，这就是冷冻电镜（CryoEM）的雏形。

冷冻电镜样品制作流程，图片来自http://creative-biostructure.com
1982年，Dubochet 博士领导的小组开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品，随着冷台技术的开发，冷冻电镜技术正式推广开来。
在Klug博士提出的三维重构技术基础上，MRC实验室的Richard Henderson博士（物理学及X射线晶体学背景）跟同事Unwin 博士1975年开创了二维电子晶体学三维重构技术，随后应用该技术技术解析了第一个膜蛋白细菌视觉紫红质蛋白的三维结构，1990达到3.5埃，这是一个非常了不起的工作，但是第一个类似的膜蛋白结构的诺贝尔奖还是被X射线晶体学家米歇尔于1988年夺走了。二维晶体最大问题在于很难长出二维晶体，因而应用范围很窄，且容易被X射线晶体学家抢了饭碗（本人刚入行第一个薄三维晶体项目就被抢了）。
上世纪90年代，Henderson博士转向了刚兴起的另一项CryoEM三维重构技术，即Joachim Frank 博士发展的单颗粒分析重构技术，无需结晶就可以对一系列蛋白或复合体颗粒直接成像，对位平均分类，然后三维重构。Henderson 博士凭借他深厚的物理学及电子显微学功底，以及非凡的洞察力，提出实现原子分辨率CryoEM技术的可行性，在理论上做了一系列超前的预见，比如电子束引起的样品漂移必须解决才能实现原子分辨率，为后期直接电子相机的突破指明了方向，他本人也投身于直接电子相机的开发。
因此，在这场电镜分辨率的革命中，Henderson博士是个不折不扣的发起者。另外，三维重构新算法的突破也有Henderson 博士的独具慧眼有关，Sjors Scheres博士在没有很强论文情况下被他看中招募到MRC后因为开发经典的Relion 三维重构算法大放异彩。
最后，我们再介绍一下发展冷冻电镜单颗粒三维重构技术的Joachim Frank博士，他也是物理学背景。Frank 博士是单颗粒分析鼻祖，单颗粒三维重构算法及软件Spider的作者。
Frank 师从德国著名的电子显微学家Hoppe博士，Hoppe学派主张对任意形状样品直接三维重构，后来的电子断层三维重构及cryoEM三维重构技术都与他的早期思想有关。Frank博士提出基于各个分散的全同颗粒（蛋白）的二维投影照片，经过分类对位平均，然后三维重构获得蛋白的三维结构，发展了一系列算法并编写软件（SPIDER）实现无需结晶的蛋白质三维结构解析技术。尤其在核糖体三维重构方面有一系列的重要开创性工作，可惜当年核糖体结构诺贝尔奖没有给他。现在给他在cryoEM单颗粒三维重构的一个诺贝尔奖，实至名归。
名表鉴定大师 2022-12-8 20:01 引用

说几句吧，毕竟也曾经是电镜从业人员。
我的博士后导师是Joachim Frank的一个学生Pawel Penczek，我开会的时候跟Joachim也聊过几次。当然后来我逃离科研阵地，跑去公司工作，就再也和电镜行业没了交集。
冷冻电镜的原理简单的来说是这样的的：首先，我们的目标是什么？得到生物大分子（比如核糖体）的三维结构！然后，我们的手段的是什么？从不同方向给它们照照片（举个例子，在美剧里大家都看过，犯罪嫌疑然都要照正面和侧面照，就有点这个意思）但是，大分子不老实老是跑来跑去怎么办，它还说这个是布朗运动？那我们就把它冷冻起来。于是乎，biubiu，我们就发明了冷冻电镜。
有了电镜还不算完，因为电镜照的是二维照片，而大分子在冷冻的时候各种姿势都有，有的头朝前，有的屁股朝前，一般照片一照就是几十万张（在此心疼一下在电镜室里没日没夜给小分子照相的研究生们）。有了这些照片以后，我们需要一个软件，把这几十万张照片综合起来，生成一个三维结构，Joachim Frank的一个大贡献，就是提供了这个软件，名字叫SPIDER（我的前老板Pawel是这个软件的主要作者之一）。
顺便说一下，不要看冷冻电镜现在这么风光，十几年前，设备不太先进的时候，冷冻电镜成像在结构生物学里属于比较冷门的领域。原因是分辨率太低，最好也只有12埃左右，而X射线晶体学的分辨率可以达到1.2埃（1埃是0.1纳米）。好比有你去买监控摄像头，X射线那个能清楚看见车牌号码，冷冻电镜那个只能模模糊糊看见是一辆车在运动而且还特别贵，你觉得你会买哪一个？当时搞X射线的普遍看不起搞冷冻电镜的，一般称我们为“泥巴体学家”。确实，当时冷冻电镜做出来的三维结构就是一团象橡皮泥一样的东西。所以说，不要看Joachim现在这么风光，他年轻时候也是吃过很多苦的，首先Joachim是德国人，不仅如此，他的博士学位也是在德国拿到的（慕尼黑技术大学）。可以想象他在在美国混有多尴尬，一来不是根红苗正，二来人脉有限，而且social能力也一般。因此只能常年呆在Albany那个比较偏僻的地方（没有对Albany不敬的意思，只是就事论事）。再看他的学生，也是其他国家来的博士后居多，比如我的前老板Pawel就是在波兰的华沙大学拿的博士。
时间到了2013年左右，冷冻电镜设备上有个很大的进步，用直接电子检测器代替了CCD成像（其中UCSF的程亦凡做了重要工作），分辨率提高了一个数量级，这下它的各种优点（主要是不需要晶体）一下子就凸显出来，the rest is history。顺便说一下，程亦凡老师的经历也很曲折，武汉大学本科，中科院博士（1991年），后来辗转挪威，美国，中国，日本多地作博士后，直到2006年才在UCSF拿到助理教授职位，2012年才修成正果（拿到Tenure）。2015年拿到HHMI，算是人生一个小巅峰。 “亦余心之所善兮，虽九死犹未悔”。这种坚持精神，值得大家学习。
最后有件事我想特别提一下，就是这个奖出来以后，有的人说施一公得奖的概率降低或者升高了。这个逻辑我不是太懂，在我看来施一公和电镜的关系就是摄影师和相机的关系。今天这个奖是发给了发明照相机的人，为什么会提高或者降低施一公作为摄影家的江湖地位我就不太理解。
名表鉴定大师 2022-12-8 20:01 引用

可以的。蛋白质结构鉴定在诺奖中画上了一个暂时的句号。我翻了一下关于蛋白质结构鉴定的化学奖1964年 D.Hodgkin X射线衍射技术测定复杂大分子和空间结构。1982年，D.A.Klug 晶体电子显微镜测定核酸-蛋白质复合体结构（病毒）2002年 John.B.Fenn /田中耕一生物大分子质谱鉴定 Kurt Wuthrich 核磁共振技术测定蛋白质结构2017年冷冻电镜技术。到此，蛋白质结构生物学的三个看门技术：X衍射，NMR , 电镜全部获得诺贝尔化学奖。
为了凸显冷冻电镜的优势，说说X-ray和NMR的缺点X-ray的最大的问题在于很多蛋白难以结晶。特别是膜蛋白等难溶蛋白质。从理论上说，电镜解析蛋白不存在衍射中相位解析困难的问题，同时电子波长要小于X-ray，理论上应该具有更高的分辨率。NMR的最大弱点就在分辨率和灵敏度。分子量过大（30KDa以上）的蛋白基本无缘核磁共振。同时需要对样品进行同位素标记和复杂的脉冲序列设计。
1982年诺奖的晶体电子显微镜主要用于测量二维晶体结构，而冷冻电镜是一个单颗粒三维晶体重构技术。传统的电子显微镜是通过负染的方式，把重金属颗粒喷涂在生物样品表面。电子显微镜其实采集到的是重金属覆盖的轮廓。因此，样品内部信息无法获得，同时无法保证重金属对生物样品的支持度良好不发生坍缩。获奖者 Jacques Duboche 研究组提出并完善了冷冻电镜的方法。他们将样品固定在玻璃态的冰中，放置于电子显微镜下观察。低温环境可以保证生物样品在电子显微镜筒内不失水，同时减少了电子辐射的影响。蛋白质被包裹在这种玻璃态的冰中宛如在水溶液一样保持本身的生理状态。
Joachim在1996年便提出了单颗粒三维重构技术。电镜三维重构技术在1968年就已经被Rosier提出。它的核心理论是中央截面定理和傅里叶变换。中心截面定理的通俗解释是：一个物体三维投影像的傅里叶变换等于该物体三维傅里叶变换中与该投影方向垂直的过原点的截面（中央截面）也就是说把一个三维的蛋白在冷冻电镜中采集到各个方向的投影图。进行二维傅里叶变换，在三维傅里叶空间重构，再进行逆傅里叶变换获得三维结构。

在电子显微镜下可以采集一个三维蛋白各个方向的电子显微像，经过傅里叶变换可以得到投影图，也就是上面说的截面。只要这个采集到的截面足够多，你就可以通过三维逆傅里叶变换拼回一个立体的蛋白质结构。更复杂的程序包括了CTF估算与修正，颗粒筛选和颗粒图像匹配。这个作为一个学NMR的人就不懂了。至于为什么获得诺贝尔化学奖，化学这个东西把和其他学科融合的太快乐。比如我自己，在一个物理研究所，做着生物医学分析，拿着化学学位。这很化学。如果有一个新技术可以解析蛋白质结构，我赌它还会获诺贝尔化学奖==
参考文献Dubochet J. Cryo-EM--the first thirty years.[J]. Journal of Microscopy, 2012, 245(3):221.Derosier D J, Klug A. RECONSTRUCTION OF 3 DIMENSIONAL STRUCTURES FROM ELECTRON MICROGRAPHS[J]. 1968.图片来源：Frank J. Single-particle imaging of macromolecules by cryo-electron microscopy.[J]. Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure, 2002, 31(1):303.
奢侈品回收 2022-12-8 20:00 引用

虽然没有给古迪纳夫心有不甘，但毕竟老爷子还坚挺，作为固体物理专业的，也分享一下冷冻电镜吧，以下阅读只需要您5分钟的时间。故事起源于蛋白质。为了了解某些关键蛋白的作用机理，生物学家们需要了解整个蛋白的构型，但早期的技术只能允许大部分人观测到一堆模糊的团状物：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=Qq8DO-4BnIY而大多蛋白质的尺寸要比头发丝还要小上几千倍，因此，科学家们之前是借助X射线晶体学成像技术来观察样品。鉴于蛋白质的松散构型，科学家们需要先对样品进行结晶——打包成稳定的、有序晶体，然后再允许X射线穿过样品进而成像：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=Qq8DO-4BnIY但问题是，不少蛋白质的结构过于松散扭曲，难以规律集群进行成晶。那怎么办，这时候聪明的科学家们想到了电子显微镜，将经加速和聚集的电子束轰击到薄样上，使用感学器件来对散射后的电子成像，而因为电子的德布罗意波长非常短，使得这种显微技术的分辨率在理论上可以高达0.1 nm，因而这种可以用来观测物质精细结构的方法叫做电子显微镜（electron microscope，缩写为EM）技术。

图片来自http://dehistology.blogspot.com/2011/06/electron-microscopy.html我们利用电子显微镜解析物相晶型的时候，需要把样品分散到液相之中，通常是5 mL的离心管就够了，但这里面的分子信息真真是浩瀚无垠：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6Qk这些纳米颗粒作自由的运动，鉴于此，我们需要把样品作成薄层然后冰冻起来才能成像，当你使用液氮对蛋白质进行冷却至低温（cryogenic temperature）后，并用电子显微镜（EM）进行观察时，这个组合技术就被叫做Cryo-EM，也即冷冻电镜。通常，研究人员会把一小滴样品液体滴到一枚小小的铜网上，然后把烘干的铜网移动到特殊的腔室中，保持100%的湿度并控制温度，然后把两侧的吸墨纸缓缓闭合，只保留下非常薄的一层分子，接着你可以把载样放到液氮浴中的液态乙烷罐中，这样样品会急速冷却以至于冰晶都来不及形成，而是形成一种叫做玻璃态晶的东东。

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6Qk这样你就会从一堆繁杂的分子中得到一层薄态玻璃冰：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6Qk但是还有一个问题，因为蛋白质小分子在玻璃晶中的取向不一样，因而当电子束打上分子时，这种取向就会在胶片上留下不同的印记，而这些印记尽管是二维图像，但是却包含了分子的三维信息。

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6Qk这时，超级相机的作用体现出来了，这种相机不仅可以提高成像质量（分辨率、衬度等等），它还可以录制影像，这就不是一个静态技术可以比拟的了。利用制作的影片，你可以看到不同的样品状态与反应的步骤，利用电脑算法对不同图像进行归类，定位到不同相片中取向相同的蛋白质分子，而后使用软件重构一张复合图像——一个更加精准、更高分辨、三维的蛋白质分子：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=Qq8DO-4BnIY在这个过程中，科学家们需要采集成千上万的蛋白质分子，进行平均化建模，而后产生了所谓的三维模型：

图片来自https://www.youtube.com/watch?v=Qq8DO-4BnIY上面这个大分子，根据UCSF的Yifan教授解说，是一个芥末受体，它能识别芥末与洋葱中辛辣的味道，这也是身体感受疼痛机制中冰山的一角。科学家们几年前已经知道了这个蛋白质，但通过这项技术，我们这些吃瓜群众可以认识到它立体的形貌，这一发明绝对是具有指导意义的，今后我们依次可以制造出更好阻断疼痛药物。而多项观测技术结合的手段现在屡试不鲜，不久的将来可以预见，会有冷冻-断层摄像（Cryo-electron tomography）、原位时间分辨的冷冻-电镜、冷冻-扫描电子显微镜（Cryo-scanning electron microscopy）技术等等。怎么样，酷不酷，帅不帅？额，我还是觉得老爷子更帅！

图片来自Battery Legend Goodenough Now Betting On Solid-State Batteries参考资料：https://www.youtube.com/watch?v=Qq8DO-4BnIYhttps://www.youtube.com/watch?v=BJKkC0W-6QkRecent developments and applications of electron microscopy to heterogeneous catalysishttp://www.nature.com/nmat/journal/v8/n4/full/nmat2380.html?foxtrotcallback=trueCryo-electron microscopy

文章排行

阅读
评论

如何通俗地理解 2017 年诺贝尔化学奖「冷冻电镜」的原理 ...

会员评论

文章排行

最新文章