从PNAS中找到自噬凋亡的研讨逻辑

之前我们练手的两篇，分数较低，因而结构和论证都比较简单。今天就来进步些难度，看一篇PNAS的文章，进步低水准。

今天我们来继续八一八科研论文是怎样炼成的，学习酸菜《三十六策》，老谈《二十四型》还有一堆套路课、文献一点通等课程还能为你的未来提供捷径还能加分哦！

废话未几说，上菜！

之前我们练手的两篇，分数较低，因而结构和论证都比较简单。今天就来进步些难度，看一篇PNAS的文章。一篇医学研讨性论文的内容常常包含着以下四个要素：疾病、表型、分子和机制。我们就以“microRNA-378 promotes autophagy and inhibits apoptosis in skeletal muscle”为例，来试着快速提取文章关键信息，中止总结提升。

文章的四要素基本在题目中就有所表示，或再分离摘要，即可反向推导出文章学术思想的灵魂所在——科学假定，进而判别出该文章能否与自己所研讨的范畴相挂钩。

首先，我们要读题，剖析四要素，也就是疾病，表型，分子和机制。

从题目与摘要我们能够取得的要素有：研讨的疾病是肌肉营养不良，研讨的主变量是microRNA-378，表型是自噬与凋亡，信号通路是mTOR/ULK1信号通路等。

因而，我们得出的科学假定是在肌肉营养不良相关疾病中，miR-378可经过mTOR/ULK1信号通路增强自噬，经过Forkhead box class O (FoxO)靶向phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)来维持自噬，靶向Caspase 9来抑止凋亡。

然后，经过酸菜36策的学习，脑海中就有这样一个逻辑框架，动物、组织、细胞、分子四维结构。有我们上述得到的科学假定，我们在这个四维结构中能够推出，作者需求证明miRNA-378在组织表白中有差别，在细胞和动物水平中有自噬与凋亡表型相关分子或功用实验的相应变更，在机制水平需求证明信号通路的直接或间接机制，在临床水平能够做biomarker和自噬、凋亡表型的相关性剖析。

下面，来看文中的Figure。

首先，我们看Figure1，在Figure1是经过动物与组织层面的检测来阐明在小鼠敲除miR-378后，可惹起骨骼肌的异常。

A图是 用qPCR法检测miR-378在C57BL/6J 鼠的不同组织包含脑、附睾的脂肪、心脏、肾、肝、肺、骨骼肌、胰腺、脾脏和睾丸的表白状况，可见miR-378在心脏、肾、骨骼肌表白较高；

B图表示用qPCR检测喂食和禁食小鼠的肌肉中miR-378水平；

C图表示正常与miR-378敲除组小鼠骨骼肌重量与体重的状况，miR-378敲除组小鼠肌肉重量相较正常组降低，差别有统计学意义。图中SOL表示比目鱼肌，GAS表示腓肠肌，TA表示胫骨前肌；

D图表示经过免疫荧光的措施，显现正常与miR-378敲除组小鼠小窝蛋白（caveolin）不同，右侧统计图GAS腓肠肌可见miR-378敲除组小鼠肌纤维变细；

E图表明正常与miR-378敲除组小鼠最大跑步机跑步距离，miR-378敲除组小鼠最大跑步距离减少，可见miR-378敲除招致小鼠跑步性能削弱；

F图为电镜图像，自噬体（箭头处）和miR-378敲除组小鼠腓肠肌的线粒体异常；

G，H图表示qPCR检测自噬相关基因LC3b, ATG12, ATG4b, Garbarapl 1, BNIP3，Beclin和VPS34表明miR-378敲除组小鼠中该类分子表白削弱。经过WB检测LC3B I,LC3B II表白状况。可见miR-378敲除组小鼠削弱；

I图在H图的基础上，进一步经过正常与miR-378敲除组小鼠分别分为喂食和禁食小鼠，进一步察看LC3B I,LC3B II表白状况，来反映自噬状况；

J图表示WB检测正常与miR-378敲除组小鼠腓肠肌的PARP与cleaved PARP表白状况。文章中提到的glucose-free DMEM (No Glu)、amino acid-free Krebs-Ringer Buffer (KRB)是两种常用的无糖与无氨基酸培育基。

自噬的过程、相关蛋白表白及检测措施

自噬过程分为三阶段：双层分隔阂的构成阶段（启动阶段）构成自噬前体（Pre-autophagosome）、自噬体的构成阶段完整自噬体（autophagosome） 、自噬溶酶体的构成与裂解阶段 最终构成自噬溶酶体（autolysosome），并降解细胞质或细胞器成分。

LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜名义，参与自噬体的构成。未发作自噬时，细胞合成的LC3B经过加工，成为胞质可溶性的LC3B I，常规表白。当自噬发作时，LC3B I被Atg7活化，经泛素样加工修饰过程，与自噬膜名义的磷脂酰乙醇胺(PE)分离，构成LC3B II(lipidated LC3 (LC3-II))。LC3B II结兼并一直位于胞内自噬体膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。

ATG4B (Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase)是一种蛋白编码基因。其相关通路有自噬通路，与该基因相关的基因本体注释【Gene Ontology (GO)】包含肽酶活性和半胱氨酸型肽酶活性、

BNIP3 (BCL2 Interacting Protein 3)是一种蛋白编码基因。与BNIP3相关的疾病包含遗传性平滑肌瘤病、肾癌和肾上腺嗜铬细胞瘤。其相关通路有军团菌病和FoxO信号通路。与该基因相关的基因本体 (GO) 注释包含蛋白均二聚活性和蛋白异二聚活性。该基因的一个重要副产物是BNIP3L。

在自噬成核过程中，ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并经过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。ATG12 与 ATG15 可能参与了自噬溶酶体的裂解。

Beclin 1编码蛋白是介导囊泡转运过程的磷脂酰肌醇-3-激酶复合体(PI3K)的组成部分，在多种细胞过程中发挥作用，包含肿瘤发作、神经变性和细胞凋亡，可选择的剪接招致多种转录变体。

p62主要参与自噬蛋白降解过程。p62能够分离泛素化蛋白，并与LC3构成复合物，从而使蛋白质转入自噬溶酶体内被降解。当自噬发作时，随着蛋白质的不时降解，p62水平也会逐步降低；而自噬缺陷时，会呈现p62汇集。p62是检测自噬活性的一个标记蛋白，其表白水平与自噬活性成负相关。

（援用：genecards网站，老谈《二十四型 第五型 自噬》）

然后我们再看Figure2，Figure 2在组织水平阐明miR-378促进肌肉细胞的自噬。

A图表示在无糖及无氨基酸状况下，C2C12肌管的miR-378表白升高；

B图表明在无糖及无氨基酸状况下，含miR-378的在无糖及无氨基酸状况下相较对照组发现LC3B II表白增高，表明miR-378可促进自噬；

C、F图WB结果阐明过表白mi-378可促进LC3BII表白,p62表白减少，抑止miRNA可减少LC3B II表白,p62表白增加；

D图经过免疫荧光更直观的表示出miR-378可促进成肌细胞中自噬相关蛋白LC3 表白；

E图表示Ad- mCherry - GFP-LC3感染的C2C12成肌细胞中，LC3的免疫荧光图像，其中转染miR-378者表白较抑止miR378组明显增强；

H图经过Baf A1与氯喹作用下中止比较LC3表白状况，进一步阐明miR-378促进自噬体构成，增强自噬通量。

3-MA，雷帕霉素，Baf A1 与 CQ在自噬中的作用

氯喹（CQ）可经过破坏溶酶体的结构和功用而抑止自噬的作用，招致自噬溶酶体汇集，能够使自噬相关蛋白LC3B II与p62等降解减少，抑止细胞自噬发作。

雷帕霉素在真菌和哺乳动物细胞中能够抑止mTOR的活性，有助于Atg13去磷酸化，活化Atg1而诱导自噬发作。

3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine ,3-MA）能够经过抑止Class III phosphatidylinsitol3-kinase,class III PI3K)从而抑止自噬体的构成。

巴弗洛霉素A1[bafilomycin A1 (Baf A1)]可酸化自噬体内囊泡物质的H+-ATP 酶质子泵抑止剂, 而 H+-ATP 酶是溶酶体发育成熟的关键酶, 巴弗洛霉素 A1抑止囊泡酸化进而抑止自噬体后期构成。

接下来我们看Figure 3，该图主要是阐明PDK1可调理miR-378对骨骼肌自噬的影响。

A图是miR- 378和PDK1-3′UTR从不同的物种中止序列比对；

B图经过荧光素酶剖析显现，转染miR-378与转染抗miR-378者对荧光素酶的表白均有影响，即从机制的水平阐明miR-378与PDK1可直接相互作用；

C、D图qPCR、WB结果表明，正向操作表明miR-378能够抑止PDK1，反之可促进PDK1表白；

E、F图在qPCR,WB检测小鼠身上敲除miR-378后PDK1 mRNA及蛋白表白升高，反向证明miR-378可抑止PDK1表白；

G图经过control,miR-378,miR-378+PDK1三组来做了一个Rescue阐明，依据“反正正”的原理中止设计，阐明miR-378是经过抑止PDK1来促进自噬；

H图经过免疫荧光的方式，依照control,miR-378,miR-PDK1分组，在Ad-mCherry-GFP-LC3–infected C2C12 成肌细胞中，进一步阐明依据荧光强弱的表白变更，更直观显现miR-378是经过抑止PDK1来促进自噬；

I图经过Control,Ad-378,PDK1,Ad-378+PDK1四组中止WB中止检测，Control，Ad-378相比p-AKt,p-mTOR，p-ULK1表白降低，阐明miR-378可经过mTOR/ULK1通路促进自噬，PDK1,p-FoxO,p62表白削弱，LC3B II表白增强，FoxO1表白增强，阐明miR-378可经过FoxO1来维持自噬，并可抑止PDK1的表白。

Control,Ad-378，Ad-378+PDK1依据”反正正“原理中止Rescue来阐明miR-378可靶向抑止PDK1来发挥促进自噬的作用；

J、K图依据Rescue口诀“反反反”，依照Ant-ctrl,Ant-378,Ant-378+siPDK1来分组，经过免疫荧光与WB阐明miR-378是经过抑止PDK1来经由mTOR/UKL1通路促进自噬。

接下来我们看Figure 4,该图主要从机制水平来阐明miR-378可靶向Caspase 9（CASP9）的3'UTR区来发挥作用。

A图miR- 378和Caspase 9-3′UTR从不同的物种中止序列比对；

B图经过荧光素酶剖析显现，转染miR-378与转染抗miR-378者对荧光素酶的表白均有影响，即从机制的水平阐明miR-378与Caspase 9可直接相互作用；

C、D、E图qPCR、WB、免疫荧光结果表明，正向操作表明miR-378能够抑止Caspase 9，反之可促进Caspase 9表白；

F图经过正反操作miR-378的表白察看PARP分子表白改动；

G-I图阐明Caspase 9的mRNA表白变更。

经过正常组与敲除miR-378小鼠中止比较，G，H图经过qPCR与WB阐明敲除miR-378可促进Caspase 9的mRNA表白升高，cleaved-Caspase 9表白升高，I图阐明敲除miR-378后Caspase9活性升高。

J图WB阐明敲除miR-378对 cleaved CASP表白升高；

K图经过敲除miR-378的KO组，KO+z-VAD组，依据结果KO+z-VAD组最大运动距离增加，阐明抑止凋亡可提升运动才干。z-VAD全称是z-VAD-FMK,一种凋亡的抑止剂；

L图经过KO组，KO+z-VAD组发现一个现象，z-VAD可减少cleaved CASP3与 cleaved PARP的表白，但是可促进LC3B II表白增高、p62表白降低，阐明其可促进自噬。返回原文阅读结果，发现查阅文献发现CASP3能够抑止自噬，即减少 cleaved Beclin 1 (BECN1)表白，促进凋亡，其在附件中也有做了KO+z-VAD组小鼠的C2C12的肌管和腓肠肌中cleaved BECN1表白降低。

接下来我们来看Figure 5,这张图在组织水平中止阐明过表白miR-378可促进骨骼肌自噬和抑止凋亡。

A图用PCR阐明造模型胜利，agomiR-378处置后的小鼠在腓肠肌与胫骨前肌中miR-378表白增高；

B图用control、agomir-378小鼠对比，PDK1、CASP9在agomir-378处置组小鼠的腓肠肌中表白减少；

C，D，E图WB结果显现agomir-378小鼠的腓肠肌中PDK1、凋亡表型相关蛋白Caspase 9,Cleaved Caspase 9,CASP3,Cleaved CASP3,PARP,Cleaved-PARP蛋白表白降低，自噬表型相关蛋白LC3B II表白升高，阐明过表白miR-378可促进自噬，减少凋亡；

F图经过自噬相关蛋白LC3b, ATG12, BNIP3, BNIP3l, Cathepsin L, Atrogin 1, VPS34, Beclin在过表白miR-378的小鼠腓肠肌较对照组升高阐明miR-378可促进自噬；

G图表明无论喂食或饥饿状态下miR-378均可促进LC3B蛋白表白，降低p62蛋白表白。

最后一张Figure 6,作者用一张关系图来表示本文触及的miRNA与相关靶蛋白调控关系。

好啦，本文的文章内容梳理就到这儿啦。框架明晰明了，文章内容也十分翔实，能进步我们对自噬、凋亡的认识。

一周中止剖析精读一篇与自己范畴相关或者感兴味的论文，细细品味，了解研讨结论和实验措施动身，重新梳理Figure组织的逻辑。哪些是中心的，哪些是可选项，以至哪些实验是作者会疏忽但经常被评审人提到返修意见中的，怎样重新组织数据能够换一种文章的论述思绪，读文章的才干也就会逐步瓜熟蒂落啦！