机械可调的丝胶原水凝胶“带动”神经干细胞攻克挫伤脊髓难关 ...

目前，脊髓损伤(SCI)依旧缺乏令人称心的治疗计划，许多脊髓损伤患者遭受持续的神经性疼痛、压疮和/或神经源性膀胱和肠功用障碍。神经干细胞(NSC)治疗是一种有出路的脊髓损伤修复治疗选择。但是，当NSC直接传送到脊髓损伤部位时，急性炎症条件会招致低细胞存活率。为此，来自韩国檀国大学的Hae-Won Kim、Jung Keun Hyun团队经过丝胶原蛋白水凝胶来处置这个问题，这种水凝胶具有硬度匹配、应力松弛和剪切变稀的特性（图1a）。机械调理的水凝胶维护从成纤维细胞重新编程的NSC最初免受注射剪切应力，并增强超越12周的长期存活。相关研讨成果以“Delivery of Induced Neural Stem Cells Through Mechano-tuned Silk-collagen Hydrogels for the Recovery of Contused Spinal Cord in Rats”为题于2022年11月29日发表在《Adv. Healthcare Mater.》上。

图1a SC水凝胶和iNSC注射输送到挫伤的T9脊髓的表示图

丝质胶原蛋白水凝胶可机械调理，可注射和可细胞输送

丝胶原蛋白(SC)二元蛋白具有物理交联性，具有合适细胞注射输送的物理化学和动态力学特性，包含由成纤维细胞重编程的诱导神经干细胞(iNSC)，在软SC水凝胶中，作者还添加了层粘连蛋白，记为“SC-L”。由于丝和胶原蛋白网络的互穿，SC和SC-L水凝胶的凝胶化时间约为11分钟(图1b)，比纯胶原蛋白凝胶的凝胶化时间短(约23分钟)。SC和SC-L水凝胶均表示出典型的粘弹性软凝胶的趋向剪切存储模量(G’)在较低频率下占主导位置，而损失模量(G”)随着频率的增加而变得更重要(图1c)；并且其弹性模量(0.4-0.5 kPa)与大块神经组织的弹性模量相似(图1d)。水凝胶的应力松弛行为(动态应力特性)表明为水凝胶中的细胞提供了恰当的机械顺应和顺应条件(图1e)；循环应力下粘度变更的测试表明在注射时水凝胶像液体一样活动，因而很容易经过微针(图1f)。当SC水凝胶被切割并放置一段时间后，它表示出自愈合行为，允许按需成型和处置(图1g)。

图1b-g 丝胶原(SC)水凝胶的特性

SC水凝胶中iNSC的可行性

接下来，作者研讨了iNSC在水凝胶中的生长。细胞生动生长超越5天;最初(0小时)在水凝胶中构成的微小细胞汇集体在培育期间变得更大(图2a)。为了进一步了解iNSC在SC水凝胶中的机械感应作用，作者用各种抑止剂对3d包覆细胞进行了处置。在5天的培育过程中，iNSC显现出一切抑止剂的簇面积和总细胞数都大幅减少(图2b)，这意味着肌动球蛋白收缩力的机械感知作用至关重要，这可能与应力松弛水凝胶基质动态发作（图2c）。

接下来，作者检测了SC水凝胶中iNSC的干性。用免疫细胞化学措施剖析Nestin阳性的细胞，Nestin是iNSC干细胞性的一个指标。结果显现，Nestin阳性细胞在培育5天的时间内，其数量和聚簇体积均有所增加(图2d)，这与总细胞剖析中察看到的趋向十分相似。mRNA表白量与蛋白表白量分歧(图2e)。

作者还测试了在注射器注射过程中，水凝胶能否能维护iNSC，由于注射相关的剪应力已知会诱导膜损伤，招致显著的细胞。PBS传送(对照细胞组)招致约20-30%的细胞，而SC水凝胶传送的iNSC简直都完好无损(图2f)。如图2g所示，经过SC水凝胶传送的iNSC能够抑止注射剪切应力相关的细胞，其中注射期间和注射后水凝胶的剪切变薄和自愈特性可能是至关重要的。

图2 机械响应水凝胶允许iNSC生长和注入输送

SC水凝胶可增强移植后iNSC在体内的长期存活才干

接着，将嵌入SC水凝胶的iNSC在损伤后30分钟注射到大鼠脊髓。用免疫组化措施剖析移植后最初(3天)和长期(12周)的iNSC存活状况(图3a)。仅iNSC组的tunel阳性iNSC的可见水平显著高于其他水凝胶组(iNSC是SC和SC-L组的~3-4倍)，阐明经水凝胶输送的iNSC在第3天的存活时间明显更长(图3b,c)。此外，作者还检查了12周时的iNSC生存率。iNSC不只出往常紧邻病变腔的区域(标记为“#”)，也出往常较远的区域(图3d-f)。在SC和SC- L水凝胶组中，iNSC存活率的量化结果显现，iNSC存活率比仅运用iNSC的对照组高约3倍(图3g)。

图3 iNSC在损伤脊髓中受水凝胶维护中长期存活

经过SC水凝胶输送的iNSC能够减轻炎症和病变腔的构成

移植的iNSC与炎症细胞的相互作用影响iNSC在体内的疗效。因而，作者从0-4周(炎症反响盛行的时期)研讨了ED1+巨噬细胞和小胶质细胞的存在。与PBS对照相比，接受iNSC的三组ED1+炎症细胞均减少，iNSC-水凝胶组比仅接受iNSC组减少更多，表明水凝胶-iNSC传送时炎症细胞浸润损伤部位的水平较低(图4a,b)。为了肯定巨噬细胞亚群表型能否被经典激活(ΦM1)或替代激活(ΦM2)，组织样本被抗iNOS或抗精氨酸酶-1抗体染色(图4c,d)。仅PBS组的大多数细胞为iNOS+，表明急性脊髓损伤的细胞主要是促炎细胞。在只需iNSC的组中，一些细胞arginase-1阳性(Arg1+)，表明iNSC减缓了炎症。作者在4周时丈量了病变腔，病变腔的大小与炎症反响的发作率相关结果显现，iNSC-水凝胶的递送显著减少了病变腔，特别是在iNSC-SC-L组(图4e,f)。

图4 水凝胶- iNSC降低炎症反响和病变腔构成

SC水凝胶中的iNSC表白神运营养因子并分化为神经谱系细胞

在移植后4周和12周剖析神运营养因子的iNSC表白。神经生长因子(NGF)、脑源性神运营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神运营养因子(GDNF)和神运营养因子3(NT3)的表白在iNSC-水凝胶组较仅iNSC组明显增加(图5a)。神运营养因子表白在4周时比12周时增加更多，可能是由于在4周时呈现了更多未分化的iNSC。在确认iNSC在炎症条件下存活并激活旁分泌信号分子的mRNA水平后，作者研讨了iNSC能否分化为特定的神经谱系细胞（图5b）。12周后进一步对组织样本进行免疫染色，发现(Tuj1+)分化的神经元构成了大量突触，并在显著水平检测到不同的基本神经元亚型，包含GABAergic神经元(GAD65/67+)和谷氨酸能神经元(VGLUT1+)(图5c)。

图5 水凝胶中的iNSC上调神运营养因子并向神经谱系分化

iNSC-水凝胶传送刺激轴突发芽进步SCI恢复

最后，依据图7a所示的时间表，每周用Basso、Beattie和Bresnahan (BBB)和梯子评分评价运动功用，持续12周。接受iNSC-SC水凝胶组的血脑管运动恢复明显高于仅接受iNSC的组，从iNSC-SC水凝胶的第3周开端，到iNSC-SC-L水凝胶的第7周开端，并持续整个12周(图7b)。阶梯评分显现(早在1周) iNSC-水凝胶组的阶梯评分比iNSC-水凝胶组高2-3倍(图7c)。仅察看到iNSC组与PBS组相比阶梯评分略有增加。这些结果表明iNSC-SC水凝胶能刺激血清素能轴突的萌发，增强iNSC在体内长期的功用，并促进脊髓恢复。

图6 水凝胶中的iNSC在12周内可改善运动功用

综上，本研讨证明了工程SC蛋白水凝胶在急性脊髓挫伤中增强iNSC功用的才干。依据SC水凝胶的理化和生物学特性，包含其凝胶化时间(~11分钟)和细胞生机(>90-95%)，特别针对iNSC的注射输送进行了机械调整，这些特性合适神经再生，如与神经组织匹配的软刚度(0.4-0.5 kPa)、应力放松行为、剪切稀释和自愈合才干，这些特别的性能有助于维护iNSC。总的来说，本研讨强调机械调理蛋白水凝胶能够维护NSC不受注射应激和严重炎症环境的影响，使其分化并发挥功用恢复损伤脊髓。

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