经典名方当归四逆汤物质基准指纹图谱及关键质量属性量值 ...

当归四逆汤（Danggui Sini Decoction，DSD），来源于张仲景的《伤寒论》，由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通、大枣7味药组成，具有温经散寒、养血通脉的作用，主治血虚寒厥证[1-2]。现代药理研讨表明，DSD可用于痛经[3]、风湿性关节炎[4]、冠心病[5]、周围神经病变[6]、雷诺病[7]等诸多疾病的治疗，临床运用普遍。DSD在2018年国度中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》中为第13方[8]。依据《伤寒论》原文记载，其煎煮措施为“当归三两，桂枝三两（去皮），芍药三两，细辛三两，甘草二两（炙），通草二两，大枣二十五枚（擘），上七味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三服。”依据国度药品监视管理局2018年5月发布《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规则》[9]，经典名方复方制剂开发必须首先进行物质基准研讨，为其后续的制剂开发提供依据。此外，国度药品监视管理局2019年3月发布《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料请求（征求意见稿）》[10]，经典名方的开发研讨要首先明白其煎煮措施及投料规格等，且“准绳上应与经典名方古代医籍记载分歧”。

目前，关于经典名方DSD的研讨多见文献考证及临床应用，少见其多个成分含量测定措施及物质基准制备工艺的研讨报道[11-12]，本研讨拟树立DSD指纹图谱并分离3种化学方式辨认进行多维度质量评价，同时树立含量测定的措施。测定15批DSD物质基准指纹图谱、指标成分的含量及出膏率，探求关键质量属性在饮片-水煎液-物质基准的传送规律，初步树立DSD的全过程质量控制体系，为DSD后续复方制剂研讨提供前期基础，并为其他经典名方的物质基准研讨提供自创。

1仪器与资料

1.1仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，沃特世科技中国有限公司；KQ-600VDB型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；C21-SDHCB9E32S型电磁炉，浙江苏泊尔股份有限公司；CP225D型十万分之一电子剖析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Genie U12型超纯水仪，上海乐枫生物科技有限公司；LDZ4-0.8型离心机，北京医用离心机厂；FD-2D型冷冻单调机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2资料

饮片信息如表1所示，委托广州采芝林药房进行采购，经广州白云山和记黄埔中药有限公司匡艳辉制药高级工程师审定均属正品。DSD流浸膏，批号为200601S，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。对照品阿魏酸（批号110773-201915，质量分数99.4%）、甘草苷（批号11610-201908，质量分数95.0%）、苯甲酸（批号100419-201703，质量分数99.9%）、绿原酸（批号110753-202018，质量分数96.1%）、芍药苷（批号110736-202044，质量分数96.8%）购自中国食品药品检定研讨院；对照品芍药内酯苷（批号39011-90-0，质量分数90.5%）、甘草酸（批号1405-86-3，质量分数96.3%）购自上海诗丹德规范技术效劳有限公司。乙腈、乙酸为色谱纯，德国默克公司；其他试剂为剖析纯。

2措施与结果

2.1DSD物质基准的制备

采用随机数表法对表1（表1中各味饮片委托广州采芝林大药房进行采购，均来自道地产区，每味饮片3个产地，每个产地5个批次）中15批次各饮片进行随机组兼并排序，组合信息见表2。经过本课题组前期考证及度量衡换算，宋代1两折算为今3 g，大枣折算为24 g，1升换算为200 mL，煎煮时间由原文记载的“煮取3升”即可明白，煎煮时间肯定为1.5 h，煎煮次数按原文记载为1次，称取处方剂量当归9 g、桂枝9 g、白芍9 g、细辛9 g、木通6 g、甘草6 g、大枣24 g，置3 L陶瓷罐中，加1600 mL [13]去离子水，武火1400 W煮沸后转文火600 W煎煮1.5 h，煎煮至600 mL，双层300目筛网滤过，即得规范煎液，平均取适量药液，4000 r/min下离心（离心半径5 cm）10 min，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；取规范煎液50 mL，冷冻单调，即得DSD物质基准。

2.2DSD指纹图谱研讨

2.2.1色谱条件色谱柱为ACE Excel 3 C 18-AR （150 mm×4.6 mm，3 μm）；活动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脱：0～18 min，8%～10%乙腈；18～48 min，10%～14%乙腈；48～70 min，14%～17%乙腈；70～85 min，17%～21%乙腈；85～95 min，21%～21.5%乙腈；95～135 min，21.5%～45%乙腈；检测波长237 nm；体积流量0.6 mL/min；进样体积5 μL；柱温25 ℃。理论塔板数以芍药苷峰计算大于5000。

2.2.2混合对照品溶液的制备分别取绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为30.10、167.70、277.50、35.50、42.45、170.40、144.30 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取DSD流浸膏2 g（物质基准1.25 g），精密称定，置50 mL量瓶中，加水定容，超声处置20 min，放冷，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.2.4指纹图谱措施学调查

（1）参照峰的选择：指纹图谱中，芍药苷的含量较高，且色谱峰稳定故选择芍药苷（峰6）作为指纹图谱的参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保存时间和相对峰面积。

（2）精密度实验：取DSD流浸膏，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记载色谱图。以芍药苷（峰6）为参照峰，计算各共有峰的相对保存时间及相对峰面积，并计算其RSD值。结果表明各共有峰的相 对保存时间RSD均≤0.32%，相对峰面积RSD均≤3.84%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性实验：按“2.2.3”项下措施平行制备6份供试品溶液，连续进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。各共有峰的相对保存时间RSD均≤0.53%，相对峰面积RSD均≤3.81%，表明该措施重复性良好。

（4）稳定性实验：取DSD流浸膏，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h进样，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。各共有峰的相对保存时间RSD值均≤0.28%，相对峰面积RSD值均≤4.10%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5指纹图谱的树立及共有峰归属按“2.1”项下制备物质基准取15批DSD物质基准、各单味药及阴性对照样品，按“2.2.3”项下措施制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。采用国度药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件对样品指纹图谱进行剖析。以样品S1的指纹图谱作为参照谱进行指纹匹配（中位数法，时间窗0.1 min），肯定了16个共有峰，并生成对照指纹图谱（R），15批DSD物质基准的HPLC指纹图谱叠加图见图1。15批DSD物质基准指纹图谱与对照图谱的相似度大于0.90。指认了其中16个共有峰，经过与对照品比较，分别为绿原酸（2号峰）、芍药内酯苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、阿魏酸（7号峰）、苯甲酸（8号峰）、甘草苷（9号峰）、甘草酸（15号峰）。如图2所示，其中1、4、9、10、13～16号峰来自于甘草；2、3、11号峰来自于木通；5、6、8、12来自于白芍。15批DSD物质基准（S1～S15）相似度结果分别为0.996、0.987、0.990、0.994、0.993、0.991、0.993、0.991、0.989、0.985、0.993、0.901、0.974、0.991、0.972，相似度均大于0.90。其中S12、S13、S15低于其他样品，阐明不同批次药材制备的物质基准样品存在一定的质量差别。

2.2.6层次聚类剖析（hierarchical cluster analysis，HCA）[14]采用SPSS 25.0数据剖析软件，对15批样品的共有峰的峰面积进行系统聚类，采用组间衔接法，丈量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图3，结果发现当欧氏距离约为8时，15批DSD物质基 准可分为3类，即样品S1～S11、S14为第1类，样品S13、S15为第2类，S12为第3类，此结果可与相似度评价结果相互印证。

2.2.7主成分剖析（principal component analysis，PCA）选择15批DSD物质基准的16个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA-P＋14.1（Demo）软件进行PCA处置，得分矩阵图见图4。15批DSD物质基准可分为3类，即样品S1～S11、S14为第1类，样品S13、S15为第2类，S12为第3类，此结果可与HCA结果相互印证。

2.2.8OPLS-DA将15批GSD物质基准的16个共有峰的峰面积导入SIMCA-P＋14.1（Demo）软件进行OPLS-DA处置，得分矩阵图见图5。结果发现15批样品聚为3类，分离以变量重要性投影（VIP）值＞1为判定规范，选择差别组分，见图6。结果共找到了4个成分，按VIP值大小排序分别为9（甘草苷）、10、15（甘草酸）、6（芍药苷）号峰。上述4个差别成分中3个来自甘草，1个来自白芍，进一步阐明严厉控制甘草饮片质量是确保DSD物质基准质量稳定的关键。

2.3DSD物质基准指标成分芍药苷、甘草苷、甘草酸定量测定

2.3.1色谱条件同“2.2.1”项下，3个成分的理论板数均大于5000，分别度大于1.5。色谱图见图7。

2.3.2混合对照品溶液的制备同“2.2.2”项下措施制备芍药苷、甘草苷、甘草酸混合对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备同“2.2.3”项下。

2.3.4措施学调查

（1）线性关系调查：分别精密吸取适量“2.3.2”项下的混合对照品溶液，加甲醇稀释，得芍药苷质量浓度为13.88、27.75、55.50、111.00、222.00、277.50 μg/mL，甘草苷质量浓度为8.52、17.04、34.08、68.16、136.32、170.40 μg/mL，甘草酸质量浓度为7.22、14.43、28.86、57.72、115.44、144.30 μg/mL的系列混合对照品溶液。取各个质量浓度的混合对照品溶液各5 μL注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定各成分的峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：芍药苷Y＝9 025.82 X －1 653.98，r＝1.000 0， 线性范围13.88～277.50 μg/mL；甘草苷Y＝17 790.30X －17 745.64，r＝1.000 0，线性范围8.52～170.40 μg/mL；甘草酸Y＝4 436.94 X －2 084.58，r＝1.000 0，线性范围7.22～144.30 μg/mL。结果表明，各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

（2）精密度实验：精密吸取中等质量浓度的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样剖析6次，分别计算峰面积。结果芍药苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.81%、1.00%、1.03%，表明仪器精密度良好。

（3）稳定性实验：精密吸取“2.3.3”项下措施制备所得的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取5 μL供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果芍药苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为2.55%、2.56%、2.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

（4）重复性实验：依据“2.3.3”项下措施平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取5 μL供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果流浸膏中芍药苷、甘草苷和甘草酸质量浓度平均值分别为4.427 9、1.075 6、2.192 8mg/g，RSD分别为2.80%、2.81%、2.87%，表明该措施重复性良好。

（5）加样回收率实验：取6份已测定各成重量的流浸膏1 g，精密称定，分别参与芍药苷4.23 mg、甘草苷1.11 mg、甘草酸2.19 mg，按“2.3.3”项下措施制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算各成分的平均回收率和RSD值，结果芍药苷、甘草苷 和甘草酸的平均加样回收率分别为98.81%、96.68%、100.75%，RSD分别为2.17%、2.33%、1.78%，表明该措施精确度良好。

2.4 DSD 物质基准指标成分在饮片-水煎液-物质基准之间的量值传送剖析

饮片的含量测定措施参考《中国药典》2020年版，选取“2.3”项树立含量测定措施中具有特征性的白芍、甘草中的芍药苷、甘草苷及甘草酸探求其饮片-水煎液-物质基准的量值传送规律，DSD物质基准水煎液中指标成分的测定按“2.1”项下制备供试品溶液及物质基准。

转移率＝wm/ WM

w表示物质基准中指标成分的质量分数，m表示物质基准样质量量，W表示饮片中有效成分的质量分数，M表示处方中的饮片质量

各药味指标成分的含量及从饮片-物质基准转移率结果如表3所示，芍药苷、甘草苷、甘草酸从饮片-物质基准平均转移率分别为52.94%、48.79%、47.39%。结果见图8。

2.5 DSD 物质基准制备过程中各药味干膏率传送规律研讨

按上述肯定的工艺制备15批次的DSD物质基准样品，测定其干膏率。干膏率的测定方式为取100 mL（n＝2）提取液或单味药材105 ℃烘干至恒定质量，计算公式为干膏率＝6 m / M ，公式中6 m 表示干膏的质量，M表示各组称取的饮片量。比较全方的理论干膏率与实践干膏率的转移规律。

结果如图9和表4所示，15批DSD物质基准全方理论干膏率 为24.26%～26.88%，实践全方干膏率为19.13%～24.58%，干膏率的平均转移率为86.40%。

理论干膏率＝(单味药干膏率×单味药生药量)/全方生药量

3讨论

DSD方中具有当归、桂枝、芍药、细辛、甘草（炙）、通草、大枣（擘）7味药，方中桂枝辛温，温经散寒以通脉，与当归共为君药；白芍、细辛共为臣药，助桂枝温通血脉[15]。

原文记载的芍药、通草、细辛和甘草均为多基原药材，经过前期文献研讨中进行的本草考证，并分离《伤寒论》所处历史时期，基本肯定DSD中所用的芍药药材基原为毛茛科芍药属植物芍药P. lactiflora Pall.的单调根；通草药材基原为木通科木通属植物木通A.quinata (Thunb.) Decne 、三叶木通A.trifoliata (Thunb.) Koidz. 的单调藤茎；细辛药材基原为马兜铃科细辛属植物北细辛A. heterotropoidesFr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.) Kitag. 的单调根；甘草药材基原为豆科甘草属植物甘草G. uralensis Fisch.的单调根及根茎。其他3味药所用基原均为《中国药典》2020年版中各自药材基原，当归为伞形科当归属植物当归A. sinensis(Oliv.) Diels.单调根，桂枝为樟科樟属植物肉桂C. cassiaPresl.单调嫩枝，大枣为鼠李科枣属植物枣Z. jujuba Mill.单调成熟果实。方中甘草原文记载为“炙甘草”，经考证该炮制品为炒甘草，炮制措施取甘草片，照清炒法（炮制通则）炒至深黄色[16]。

课题组在树立指纹图谱和含量测定措施时，对比了4.6 μm及3 μm不同粒径色谱柱，3 μm粒径的色谱柱分别度更好，因而，最终选择采用粒径为3 μm的色谱柱，树立复杂中药复方制剂的含量测定措施，在活动相体积流量选择过程中，由于色谱柱的内填物粒径较小，为3 μm，且色谱柱为150 mm的短柱，因而选用0.6 mL/min的体积流量，从而避免高体积流量招致的高压对高效液相色谱仪器及色谱柱的损耗。

采用了Agilent 1260和Waters 2695高效液相色谱仪测定供试品溶液中各成分的含量，结果发现各成分含量差别不大；采用ACE Excel 3 C 18-AR （150 mm×4.6 mm，3 μm）、Titank C 18（150 mm×4.6 mm，3 μm）、SuperLu C 18（150 mm×4.6 mm，3 μm）3种品牌的色谱柱测定各成分含量、分别度、理论塔板数及拖尾因子，结果发现各成分含量差别不大，分别度良好，理论塔板数较高，拖尾因子契合请求，阐明该含量测定措施的耐用性良好。

在供试品溶液的制备过程中，调查了水和不同体积分数的甲醇超声提取对各成分含量的影响，结果发现各成分含量差别不大，其中水提取的供试品溶液较为廓清且重复性较好，因而，选择水作为其提取溶剂以最大水平保存DSD的物质概貌。课题组在前期树立色谱条件时，将桂皮醛归入含量测定的范围中，但由于其性质不稳定且极性小在水中的提取率较低，最终在物质基准中的含量仅为0.01 mg/g，不倡议对其进行含量检测，后续研讨可思索进行薄层色谱的鉴别。

在分离3种化学方式进行15批次DSD物质基准多维度质量差别剖析时，结果表明构成差别的主要缘由来源于甘草中的甘草苷（峰9），其次是分离课题组后期质谱剖析肯定的芹糖甘草苷（峰10）及甘草酸（峰15），其缘由可能是由于甘草不同部位对应含量不平均而招致的差别[17]，此外，甘草不同产地的含量也存在一定差别，甘草中总皂苷、总黄酮和甘草酸含量较高的经度区间均在95°0′～99°59′和104°0′～118°59′，天文位置上这2个点分别处于新疆与甘肃的交界、内蒙古与吉林的交界[18]，经典名方开发过程中倡议采用道地产区的优质药材并严厉依照饮片部位、大小等进行分类以确保物质基准的质量稳定性。

经过展开指纹图谱研讨，共指认了16个共有峰，15批物质基准的相似度大于0.90。同时指认了 绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸 7个成分，15批物质基准中芍药苷、甘草苷、甘草酸的平均质量分数分别为8.267 8、2.533 3、5.160 5 mg/g，其中15批物质基准芍药苷、甘草酸的质量分数均在均值的70%～130%，甘草苷含量范围为2.56～3.35 mg/g。芍药苷、甘草苷和甘草酸质量分数均大于1 mg/g，可作为含量测定指标，探求量值传送规律。

经典名方物质基准的制备工艺主要包含煎煮、滤过、单调等工艺，本课题组前期经过调查煎煮工艺过程中所用的加热源、煎煮容器、加热火力、能否浸泡、过滤和单调措施，肯定了物质基准制备工艺的各项参数。以肯定的工艺制备15批次的物质基准，从指标成分的含量、特征图谱、干膏率3个方面展开质量相关研讨，拟从多个角度剖析并论述制备过程中的质质变更规律探求饮片-中间体-物质基准的量值传送规律，其中芍药苷、甘草苷、甘草酸从饮片-中间体的传送率接近50%，证明水溶性成分在制备过程中转移率高。在剖析15批次DSD物质基准干膏率时，干膏率均在均值的±10%以内，但实践干膏率要低于理论干膏率的数值，其缘由可能是由于单味药进行煎煮时其吸水量要大于全方进行煎煮时的吸水量，因而理论干膏率的数值要大于实践值[19]。

本实验树立DSD指纹图谱及含量测定措施，从饮片入手探求饮片-中间体-物质基准的量值传送规律，证明DSD物质基准在制备过程中其指标成分的含量、指纹图谱相似性及干膏率均稳定。

利益抵触一切作者均声明不存在利益抵触

参考文献（略）

来 源：储烟阗，匡艳辉，严曾豪，王德勤，郭海彪，张偲偲，刘晓秋．经典名方当归四逆汤物质基准指纹图谱及关键质量属性量值传送规律研讨 [J]. 中草药, 2023, 54(3):746-754.