|
作者：中华医学会呼吸病学分会 通讯作者：曹彬，中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科 国度呼吸医学中心 国度呼吸疾病临床研讨中心 中国医学科学院呼吸病学研讨院 首都医科大学呼吸系感染临床诊疗与研讨中心；瞿介明，上海交通大学医学院隶属瑞金医院 上海交通大学医学院呼吸病研讨所，上海市呼吸传染病应急防控与诊治重点实验室 摘要 近年来，宏基因组二代测序（mNGS）技术在下呼吸道感染（LRTI）病原诊断范畴得到了普遍应用，国内临床医师在mNGS的临床应用方面已积聚了一定的阅历和证据。但mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景仍缺乏规范，mNGS讲演的临床意义解读也缺乏专业的指导意见。本共识基于mNGS在我国LRTI病原诊断方面的应用理论，梳理mNGS在LRTI应用范畴的瓶颈问题，汇总身手域专家意见，明白了mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景，为mNGS讲演临床意义提供了一条合理可行的解读途径，以期规范mNGS在LRTI中科学合理应用。 宏基因组二代测序（metagenomic next -generation sequencing，mNGS）是近年来兴起的基于核酸检测的微生物审定技术，由于其非预设性、高通量等优点而得到普遍应用 ［1-2] 。下呼吸道 感染（lower respiratory tract infection，LRTI）主要包含社区取得性肺炎（community-acquiredpneumonia， CAP） 、医院取得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）、免疫抑止宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症兼并感染等类型，临床表示多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别艰难，加之mNGS技术自身存在的局限性，mNGS诊断效能的发挥有赖于选择恰当患者、采用适合标本以及中止合理的解读。固然国内就mNGS的技术要点和临床应用已有数部专家共识，但尚缺乏针对LRTI临床理论中细致问题的指导意见。为此，中华医学会呼吸病学分会发起并组织呼吸与危重症、临床微生物检验、感染等多学科的专家撰写本共识，以期规范mNGS在LRTI中的临床应用，为更好地规范解读mNGS讲演提供指引。LRTI诊断要点、主要病原谱及特定致病微生物的风险要素本共识不再赘述，可参考相关指南或共识［3-7］ 。 本共识采用问答的方式，首先提出需求阐明的问题，经共识写作组讨论后肯定入选问题，在梳理临床证据的基础上给出每个问题的引荐意见及理由，并附上典型应用案例及其解析，方便读者控制共识要点。 本共识适用于青少年和成人LRTI。 一、LRTI病原学诊断措施学 问题1：mNGS 和传统微生物检测措施相比的优势与缺乏是什么？ 传统微生物检测措施技术成熟，牢靠性较高，临床应用理论多；mNGS技术理论上能非预设性、一次性检测未知病原，检测范围更广，但存在技术复杂、讲演解读艰难等缺乏。与传统微生物学检测措施相比，mNGS的优缺陷见表1［811］ 。不同的病原学诊断措施都有其各自的适用场景与前提，需求依据患者群体、病情特性、可疑病原微生物类别、当地实验室条件，选择适合检测措施。
二、患者的选择 问题2：哪些疑似LRTI 的临床场景需思索经过送检mNGS 明白病原微生物？ . 免疫抑止宿主疑似发作LRTI且临床表示提示非CAP常见病原微生物所致者。免疫抑止宿主包含原发性免疫抑止宿主、停顿期恶性肿瘤患者或感染前1年内罹患恶性肿瘤患者（不含Ⅰ期肺癌等早期恶性肿瘤或局限性皮肤癌）、正在接受化疗的恶性肿瘤患者、HIV感染伴CD4+T淋巴细胞计数<200/μl、实体器官移植受者、造血干细胞移植患者、长期运用较大剂量糖皮质激素治疗患者（等效泼尼松≥20 mg/d且持续≥14 d，或等效泼尼松累积剂量>700 mg）、接受生物免疫调理剂治疗患者［如抗肿瘤坏死因子（TNF）α单克隆抗体等］、接受缓解病情抗风湿药或其他免疫抑止药物（如环孢素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等）治疗的患者、各种缘由招致的粒细胞缺乏患者（外周血中性粒细胞计数<0.5×109/L）等［1213］ 。 2. LRTI患者发病初期即呈现需求运用血管活性药物的感染性休克、需求有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功用不全等危及生命的状况时；LRTI经规范阅历性抗感染治疗48~72 h后，感染病症仍持续加重或影像学快速停顿者。 3. 汇集性发病疑似具有传染性、但无法明白病原体的LRTI；有特殊病史（如近期境外或野外旅游史）且阅历性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床思索特殊病原体（如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热衣原体等）感染且病势迅疾或拖延者，常规培育艰难或所在医疗机构无法提供牢靠的传统检测计划时。 4. 患者有LRTI病症或影像表示，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程拖延，需鉴别能否由非感染性疾病所致（如结缔组织疾病的肺部累及、肺淋巴瘤等），能够在常规病原微生物检测、感染生物标记物、病理等相关检查同时送检mNGS以辅佐鉴别诊断。 问题3：哪些临床场景通常不倡议送检mNGS？ 1. 免疫功用健全宿主罹患LRTI（包含重症肺炎），经过规范的阅历性抗感染治疗病情已好转。 2. LRTI曾经过其他措施取得病原学结果，与临床特性相符，或针对性治疗有效。 3. 无法获取优质标本。 问题4：如何依据所在医院微生物检测才干差别化送检mNGS 诊断LRTI？ mNGS技术自身具有价钱昂贵、技术复杂、结果解读难度大的特性，不倡议mNGS替代传统生物检测。在传统微生物检测才干缺乏的医疗单位，关于疑问、复杂或危重感染病例，能够思索将mNGS作为传统的弥补伎俩。准绳上应首先针对可疑病原微生物选择牢靠的检测措施，包含PCR等特异性的分子检测，但在缺乏相应检测伎俩的状况下，可将mNGS作为备选。例如，疑诊病毒性肺炎或非典型病原体肺炎患者，应首选针对常见呼吸道病毒和非典型病原体的PCR 或多重PCR 和（或）抗原检测，在常规检测阴性或本机构无法中止相关检测时，可将mNGS作为重症患者的选择。 三、标本选择、采集和运送规范及质量评价 问题5：如何依据LRTI 特性选择mNGS 送检标本类型？ 在LRTI的病原微生物诊断中，可用于mNGS检测的标本包含痰（含诱导痰）、气管吸收物、支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluids，BALF）、经支气管肺活检（transbronchial lungbiopsy，TBLB） 标本、经支气管内超声（endobroncheal ultrasonography，EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等［1419］ 。选择mNGS送检标本类型时应思索下列要素：（1）标本中的病原微生物载量；（2）标本中污染或定植微生物的含量及其对检查结果的干扰；（3）标本中人源序列的含量及其对检测结果的干扰；（4）标本采集的难易水平及相关操作风险；（5）标本采集所需求的医疗费用。表2比较了常用呼吸道标本的临床适用场景。
问题6：样实质量如何保障，标本保存和运输条件是什么？ 1. 保障mNGS送检标实质量的主要措施：mNGS在采集、运输、保存等多个环节易污染，影响结果判读。（1）选择高质量的呼吸道标本，标本采集时应尽量避免污染。（2）尽量由特地技术人员中止采集，可参考临床微生物分子检测规范，对医护人员中止采集运输微生物标本等方面的培训。（3）规范采集措施和送检流程：关于痰液标本采集，医护人员应首先判别患者能否有自主咳痰的才干，监视并辅佐患者，清水漱口2~3次，用力咳出深部痰3~5 ml，保存在无菌杯内；若为气管插管患者，无法自主咳痰，可经过气管插管中止抽吸，留取标本在无菌杯内；BALF标本采集，应在支气管镜的引导下，运用无菌生理盐水多次灌洗，留取5~10 ml标本放入无菌管中，尽快送至检测实验室；肺组织标本采集，应尽量对感染部位或边沿中止取材，保存在无菌杯中，尽快送至检测实验室。尽可能在初次抗菌药物运用或更改治疗计划前中止采集。尽量运用有螺口的无菌杯或运用封口膜中止密封，减少运输和保存过程中的污染。（4）信息标注完好：患者基本信息，临床病症（包含现病史和既往史等），标本采集时间、措施，抗菌药物运用种类及其持续时间，临床医生的初步诊断及对致病微生物的初步判别等。（5）针对不同的标本类型，制定标本接纳或拒收规范。如合格的痰标本应白细胞>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，或白细胞/鳞状上皮细胞>2.5；合格的BALF标本鳞状上皮细胞应<1%，镜检现场评价有助于进步采样质量。实验室在接纳到标本后，应尽快评价标实质量。关于分歧格的标本，应与临床沟通后尽量重新采集。若重新采集难度较大，则在相应标本的检测结果中应明白标注标实质量分歧格，在对该标本的测序结果中止判读时应思索标实质量对检测结果的干扰。 2. mNGS 送检标本的保存请求：（ 3. 标本的运输请求：（1）24 h内送抵实验室并开端检测，可思索冰袋低温运输；（2）24~72 h内送抵应干冰运输，送抵后应立刻中止标本前处置和核酸提取。 4. 需求中止去宿主核酸处置的标本保存和运输留意事项：除了上述留意事项外，此类标本普通要尽量保障病原微生物完好性，避免碾磨或多次冻融。 问题7：哪些LRTI 需求在中止DNA测序的同时送检RNA测序？ RNA病毒（附表1）惹起的LRTI通常有一定的时节性、盛行性或地域性。倡议检测措施首选单重或多重PCR检测或相应的抗原检测［2021］ 。若当地医疗机构无相应检测才干，或PCR检测阴性但依然高度狐疑时，可在送检mNGS DNA测序的同时中止RNA测序。下列临床状况可供参考：（1）呼吸道RNA病毒感染盛行时节（主要是冬春时节以及南方的夏季）、有相应盛行病学史的患者呈现疑似呼吸道病毒感染的临床和（或）影像表示。（2）LRTI兼并以下状况时：免疫抑止宿主；发热伴严重血小板减少或凝血功用障碍；急性肝肾功用损伤；急性神经系统病症。 四、mNGS的关键实验室技术参数 问题8：mNGS 检测讲演需求关注哪些内容？ mNGS 检测讲演从检测技术角度应包含如下内容：规范化后的微生物特异性读长（reads）数/序列数、规范化中英文称号、相对丰度、阈值、基因组掩盖度图。可选内容有：相应部位病原微生物列表、微生物序列与人源核酸序列的比值、测得总序列数、质量合格序列数、可比对至微生物数据库序列数、测序质控图、耐药基因、毒力基因等。 讲演微生物的版块可按细菌、病毒、真菌、寄生虫、特殊病原体（支原体、衣原体、立克次体等）5大类分别罗列。 主要参数定义及其意义：（1）reads：测序仪单个测序反响所得到的碱基序列，二代测序平台普通长度为50~75 bp的片段。（2）reads数：指测序取得的某种微生物属/种碱基序列的数量。病原微生物属/种水平上检出的reads数与当次实验的总测序数据量直接相关，为避免总测序数据量上下的干扰，应对检出reads 数中止规范化之后中止讲演。（3）掩盖率：指抵达给定深度的测序碱基占整个基因组或目的区域的百分比。没有抵达给定深度的部分称为盲隙（gap）。通常同时运用掩盖率和深度描画测序结果。掩盖度图采用病原全基因组方式图的方式，展示病原检出位点及检测次数的散布状况。测序深度指测序得到的碱基总量与基因组大小的比值，或可了解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。（4）相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物序列在相应5大类微生物类别中的散布比例。丰度越高，表示该微生物所占比例越高。它只能指示同一样本中某微生物的相对数量，不能用于不同样本之间的比较。（5）Q值：指质量分值，用于权衡测序精确度，公式为Q=-10log10P，其中 P 代表该碱基被测序错误的概率。如Q20表示该碱基检测错误的概率为1%。（6）RPM：每一百万条测得序列包含的阳性reads 数（reads per million）。（7）RPTM：每一千万条测得序列包含的阳性reads数（reads per ten million）。 五、mNGS讲演解读 问题9：mNGS 检测结果用于LRTI 病原学诊断时应遵照何种流程和途径？ 1. 剖析讲演质量，判别结果可信水平：依据送检标本类型、讲演方式及内容判别检测结果能否规范可信。 2. 对mNGS 检测出的微生物中止分级：参照附表1判别mNGS检出的微生物为致病性微生物、条件致病微生物还是定植微生物。致病性微生物在肺内定植可能性低，阳性结果多思索为招致感染的病原。条件致病微生物需分离患者的宿主要素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反响、传统微生物学检测结果综合剖析进一步判别能否致病。定植微生物惹起LRTI 的可能性低，多不思索致病，但吸入性肺炎、肺脓肿、脓胸等混合性感染时，口腔定植微生物也可能致病。经皮穿刺肺活检标本或胸腔积液标本检出的皮肤定植微生物，通常不致病。遇到不熟习的微生物，可借助病原检索工具https：//www. chinapneumonia.cn/pathogens查询其在既往感染性病例中的报道。 3. 依据临床特征，分离mNGS微生物分级中止临床决策（图1）：如肯定为致病病原体（注：此处致病病原体为临床决策后的微生物分级，不同于上文致病性微生物），可依据该结果中止针对性治疗。如判别为可能致病病原体，则需评价患者病情状况：危重症患者，可分离临床特征先依据mNGS结果调整抗感染计划，同时寻求其他支持证据（如临床微生物室涂片/培育结果、抗原/抗体检测结果、PCR检测结果等）综合判别其致病的可能性和中止针对性治疗的必要性；非危重症患者可先寻求其他支持证据，再调整治疗计划。
4. mNGS阴性结果的临床决策：若mNGS结果为阴性，但综合临床特征，仍激烈狐疑为感染性疾病，则倡议对讲演中的背景微生物、原始数据列表或其他病原微生物检测结果中止剖析（图1）。若临床特征支持非感染性疾病，应对原发疾病中止诊治。 5. 组织多学科会诊（multidisciplinarytreatment， MDT）：若经过以上流程，仍无法确认致病病原体，可组织MDT讨论。 6. 阅历总结：鉴于mNGS 用于诊断LRTI 尚缺乏充沛的循证医学证据，因而，临床医师在运用每一例讲演后应中止回想性剖析总结，积聚临床阅历。 问题10：如何对mNGS 检测讲演的微生物中止致病概率分级？ 依据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物和定植微生物（附表1）。条件致病微生物的判别需求分离患者的宿主要素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反响、传统微生物学检测结果综合剖析。 免疫抑止宿主发作机遇性感染的风险更高，病原微生物包含肺孢子菌、分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉属、毛霉目、隐球菌属、巨细胞病毒（CMV）、铜绿假单胞菌等［2224］ 。免疫正常宿主LRTI依照起病场所分为社区起病［2527］ 和医院起病［28 29］ 。社区起病的LRTI应排查盛行病学和特定病原微生物的接触史，如疫区、传染源、禽类、蝙蝠等接触史，应思索到结核分枝杆菌、禽流感病毒、隐球菌属、组织胞浆菌属等病原微生物。较长时间的抗感染治疗会影响病原微生物检出［3032］ ，阅历性治疗失败后应尽快完善检查并需求思索未能有效掩盖的病原微生物。 常用于辅助LRTI判别推测感染病原体的理化项目包含：血常规及外周血细胞分类、降钙素原（procalcitonin，PCT）、C 反响蛋白（C reactiveprotein，CRP） 、红细胞沉降率（erythrocytesedimentation rate，ESR）等，部分特殊感染还可能影响肝肾功用、凝血功用；其他理化指标如肿瘤标记物、自身抗体谱、免疫球蛋白、补体等常用于与非感染性疾病的鉴别诊断。 胸部影像学改动方面，大多数病原微生物都可招致肺实变，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、腺病毒等［3334］ 。肺部结节伴空泛构成常由真菌招致，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属等；也能够见于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、放线菌属、诺卡菌属惹起的感染。洋溢性磨玻璃样病变主要见于肺孢子菌、肺炎支原体和病毒（如CMV、流感病毒等）［35］ 。 mNGS 检测结果的解读必须分离常规微生物实验室检测，包含但不限于涂片和培育、特殊染色、γ干扰素释放实验、单重/多重PCR或一代测序等分子生物学检测，真菌G实验、GM 实验、曲霉IgG抗体、寄生虫血清特异性抗体、隐球菌荚膜多糖抗原，肺炎链球菌、嗜肺军团菌尿抗原检测等。 问题11：如何依据mNGS 阴性讲演作出临床决策？ mNGS可能呈现阴性结果，即未讲演明白病原体。对此应分离临床和常规微生物实验室检测结果，综合判别是真阴性还是假阴性（图1）。 真阴性指患者肺内病灶并非是感染性疾病所致，如洋溢性间质性改动可能为结缔组织疾病肺累及或其他洋溢性实质性肺疾病（diffuse parenchymal lung disease，DPLD）。 假阴性是指未能检出感染致病微生物。通常见于以下状况：（1）技术缘由而招致的假阴性，例如部分呼吸道病原微生物外壁很厚或脂质成分高［3637］ ，核酸提取过程中难以破壁，致核酸未彻底释放，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属和诺卡菌属、分枝杆菌属等［3839］；标本贮存或者运输问题致样本核酸降解，如流感病毒等RNA 病毒易呈现该状况；（2）所运用的数据库不全，招致检出病原微生物序列未精确注释；（3）生信剖析错误而致漏报致病微生物；（4）标本中人源核酸过高；（5）样本中病原微生物载量低于mNGS最低检测下限，或测序数据量太低未能掩盖到该病原微生物［40］，例如已接受有效抗微生物药物治疗而招致病原微生物负荷显著降低而难以被检出；（6）采样不规范或标本类型不适合（详见问题13）等。当mNGS 回报阴性结果时，临床仍不能扫除LRTI，临床医生应进一步详尽了解病史、发病特性及诊疗经过及治疗反响，分离影像学特性，重复送检常规病原学检查，必要时可送检不同部位标本（如BALF、血、肺组织等）中止mNGS检查，并动态评价患者对立感染治疗的反响以辅佐进一步明白疾病类型。 问题12：mNGS 讲演中呈现多种病原微生物如何解读？ mNGS检测中呈现多种病原微生物时，引荐首先经过显微镜检查、培育、抗原、PCR等措施确认，并分离临床特征解读。必要时可经过不同部位标本mNGS检测结果中止相互印证。 mNGS可在一份标本中检测到多种微生物，当呈现以下状况时，思索其中一种或多种微生物为假阳性结果：（1）标实质量分歧格；（2）标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；（3）检测过程中背景菌的质量控制不严厉；（4）患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特性和影像特征与检出的微生物不相符；（5）无法用其他微生物学措施考证；（6）治疗反响和疾病转归与检出的微生物不相符。 以下临床场景多支持mNGS检出的多病原微生物为真阳性结果：（1）误吸风险或明白误吸史的患者，呈现多种常见口腔定植菌，需思索吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和（或）培育中检出相应的混杂菌群。（2）CAP患者有时会呈现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染［4142］ 。（3）免疫缺陷宿主LRTI常发作细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。 问题13：标本类型对解读mNGS 讲演有什么影响？ 1. 痰（包含诱导痰）、气管吸收物、BALF及各种经支气管肺活检标本：（1）易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染，主要包含念珠菌属、链球菌属、葡萄球菌属、奈瑟菌属、厌氧菌等。（2）BALF标本中致病微生物的载量通常较高，受非致病微生物和人源核酸的干扰较小，当疑似感染部位BALF标本的mNGS检测结果为阴性时，固然不能据此完整扫除感染［18］ ，但可作为扫除感染的重要依据，应分离临床表示、肺部影像表示、抗感染治疗反响及其他病原微生物检测结果重新审视感染的诊断能否正确。（3）经支气管肺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反响性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，所以其阴性结果并不能扫除感染［18， 38， 43］ 。 2. 胸腔积液与肺组织标本：（1）经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、耻垢杆菌、丙酸杆菌等。（2）经皮肺穿刺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反响性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，因而其阴性结果不能扫除感染［18， 38， 43］ ，但假如mNGS的送检标本为大块的外科手术活检或切除标本，其阴性结果应该能够作为扫除感染的重要依据；（3）脓胸中固然致病微生物的载量较高，但也同时存在大量的炎症细胞，人源核酸占比高，mNGS检测过程中的去人源核酸操作可能招致检测结果呈假阴性。 3. 血液：（1）正常人的血液中可能存在皮肤、肠道或上呼吸道定植微生物死亡后崩解产生的微量核酸片段，血液检出致病微生物序列不代表该病原微生物来自呼吸道，也可能来自肠道或者其他部位。（2）血液标本检出CMV、EB 病毒等DNA 病毒时，只能阐明血液中存在病毒核酸，能否存在病毒性肺炎需求分离临床表示、肺部影像表示和下呼吸道标本的检测结果综合判别。（3）血液标本中致病微生物的载量常常较低，而且检测结果受人源核酸的干扰较大，其阴性结果不能扫除感染 问题14：mNGS 讲演中低reads 数微生物如何解读？ 1 . mNGS讲演一些病原微生物的reads数低时，应从以下几个方面加以思索：（1）某些病原微生物的核酸提取效率低和（或）标本中该病原载量较低；（2）采样、运输和实验过程中引入污染可能，分离临床剖析之后，若思索此低reads微生物不是致病微生物，应思索污染或者假阳性结果；（3）生信剖析中呈现假阳性结果。 2. 临床医生应分离患者临床表示、影像学、常规微生物学检测结果，综合判别该低reads病原微生物的临床价值。假如狐疑此微生物感染，条件允许时采用另一措施考证。检测出低reads病原微生物无法用临床微生物常规措施中止考证时，可请求检测方提供该微生物原始数据，直接与高质量的参考基因组比对，假如此病原微生物意义严重，条件允许，也能够自行设计PCR 引物或一代测序等考证。（1）某些微生物核酸提取效率较低，致其检出reads数少，例如，BALF mNGS测出少量结核分枝杆菌的reads，应关注Xpert MTB/RIF能否阳性；BALFmNGS测出少量新型隐球菌的reads，应关注外周血或BALF 隐球菌荚膜多糖抗原检测结果；BALFmNGS 测出少量曲霉菌的reads，应关注BALF GM和（或）曲霉菌属IgG抗体结果；（2）血浆cfDNA 测序关于胞内病原体（如立克次体、衣原体等）测得的reads常常较低；（3）假如血或呼吸道标本mNGS讲演低reads 数的病毒，应关注PCR 检测结果；（4）BALF讲演某些易培育的细菌低reads数，应关注BALF细菌培育的结果；（5）血浆mNGS讲演一些低reads数微生物时，有可能是其他部位的感染，微生物被抗菌药物、人的免疫细胞裂解后释放出游离核酸，循环入血后被核酸外切酶裂解成小片段的cfDNA，也可能是其他部位定植的微生物，例如造血干细胞移植患者常常肠道屏障受损，可从血浆mNGS中检测出低reads数的部分肠道微生物。 3. 关于难以肯定临床意义的低序列数微生物，必要时可中止MDT讨论。 问题15：依据mNGS 讲演结果，何种状况下应该思索追踪mNGS 检测的原始数据列表？ mNGS检测结果讲演还存在一定的漏报比例，特别是胞内感染或破壁艰难的病原微生物、临床少见的病原微生物。检测报揭露现的这些病原微生物信号偏低，且和阴性对照检出的序列数相当时，实验室可能会思索不讲演。因而，假如临床上依据患者的病史、影像学和常规实验室检查依旧高度狐疑感染性疾病，质疑mNGS 讲演给出的检测结果时，能够思索向检测实验室追踪检测结果的原始数据列表，分离临床资料在其中查找可能的病原微生物。 问题16：LRTI 病原诊断中耐药基因、毒力基因意义如何？ mNGS可提供耐药基因与毒力基因，但受限于序列读长和测序深度，尚有一定局限性：（1）关于如水解酶等耐药机制，难以取得基因全长序列，不能深化剖析耐药基因亚型。（2）基因点突变是病毒（如CMV、流感病毒等）和结核分枝杆菌等常见的耐药机制，需求足够的测序深度和精准度，才干检出相关基因突变，预测耐药信息。（3）mNGS结果易受标本类型及质量等要素影响。检出多种微生物时，耐药与毒力基因难以精准匹配到细致微生物。（4）难以肯定耐药或毒力基因型与其表型的分歧性，即mNGS检测取得的基因信息只能定性地提示致病微生物可能具有某一种耐药机制，但无法肯定该耐药基因能否表白，也无法得出药敏表型。（5）耐药基因与毒力基因仅占病原微生物全基因组的一小部分，检测敏感度有限，假阴性率高。因而，应谨慎解读mNGS中耐药基因和毒力基因的检测结果。 六、多学科会诊（MDT） 问题17：如何分离mNGS 讲演组织疑问LRTI MDT？ 1. 针对疑问LRTI病例的会诊，倡议由医务部门或相关科室，组织呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药等专业人员共同参与［44］ 。必要时能够扩展会诊参与范围，如特殊部位思索对应专科，特殊年龄思索儿科、老年病、感染控制等专科，特殊状况思索病理、影像等，必要时约请熟习mNGS实验流程的生信和技术人员参与。会诊应立足临床信息，并盘绕mNGS讲演及其他微生物检验结果中止解释，对相应感染中止判别，对进一步处置和感染控制给出倡议。 2. 如mNGS讲演检出具有公共卫生保险隐患或国度法定传染病的病原微生物时，应严厉依照国度传染病法规和院内传染病防控管理请求，对患者及接触患者的会诊人员、患者标本综合处置，严厉执行隔离与上报制度。 七、瞻望 八、场景再现/真实案例（附录1） 场景再现是经过病例恢复真实场景，使读者更好天文解共识，由于篇幅有限，每个病例的临床资料不能完好呈现，请大家在阅读时重点关注mNGS的临床应用。
附录1 场景再现/真实案例 场景再现1：mNGS适用的临床场景及标本选择患者男，40 岁，因“高热、咳嗽、咳痰、咯血、呼吸艰难4 d”诊断肺炎、呼吸衰竭，急诊气管插管有创机械通气治疗后转入RICU。既往因IgA肾病激素及免疫抑止剂治疗2个月。院外给予美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、利奈唑胺、卡泊芬净、更昔洛韦等治疗效果不佳。入院时生命体征：脉率（HR）107 次/min，血压（BP）112/69 mmHg，呼吸频率（RR）30 次/min，氧合指数（PaO2/FiO2）87 mmHg。血白细胞（WBC）11.95×109/L，中性粒细胞比例（NEUT%）98.7%，C反响蛋白（CRP）>370 mg/L，降钙素原（PCT）72.89 ng/ml，肌酐（Cr）376.1 μmol/L，肺CT示双肺洋溢磨玻璃密度渗出影和实变影，纵隔气肿。下一步应如何布置病原学检查？ A：送检气管吸取物涂片+细菌/真菌培育+药敏、军团菌尿抗原、非典型病原体和常见呼吸道病毒RTPCR等病原学检测； B：送检BALF mNGS DNA+RNA检测； C：送检BALF mNGS DNA 检测，同时送检非典型病原体和呼吸道病毒RTPCR、军团菌尿抗原、六胺银染色、真菌抗原+涂片+培育、细菌培育+药敏等病原学检测； D：送检BALF mNGS DNA+RNA 检测+军团菌尿抗原、六胺银染色、真菌抗原+涂片+培育、细菌培育+药敏等病原学检测。 解析：该患者为免疫抑止宿主，急性起病，停顿疾速，病情危重，曾经呈现Ⅰ型呼吸衰竭，WBC、CRP及PCT显著升高，提示细菌或真菌感染可能性大，肺CT表示不除外同时兼并病毒或肺孢子菌感染可能，病原学检查应尽量掩盖可能的致病原，包含细菌、真菌、DNA病毒和RNA病毒，并请求时效。BALF mNGS DNA+RNA能全面掩盖各类致病原，但检测讲演时间超越24 h，所以应辅以军团菌尿抗原、呼吸道病毒RTPCR、涂片六胺银染色镜检等其他更快速的病原学诊断措施。细菌培育固然耗时较长，但能提供潜在致病菌的抗菌药物药敏信息，有助于精准调整抗菌药物。在标本选择上，BALF更少遭到气道定植微生物和人源性核酸的干扰，在mNGS 中优于气管吸取物。思索到RTPCR 检测RNA 病毒的敏理性优于mNGS，在已展开呼吸道病毒RTPCR检测的单位，倡议优先选择计划C，而在未展开呼吸道病毒RTPCR检测的单位，则可选择计划D（参见共识中的问题2、问题4和问题5）。 患者转归：由于接诊医院缺乏嗜肺军团菌尿抗原检测技术和肺炎常见致病原RTPCR等核酸检测技术，入院后疾速中止了BALF mNGS，结果回报嗜肺军团菌，思索为重症军团菌肺炎，据此停用了抗病毒和针对肺孢子菌的阅历性治疗，加用莫西沙星增强了抗军团菌治疗，同时积极中止器官支持治疗，患者最终病情好转，脱机拔管，顺利出院。 场景再现2：已知病原学结果与临床特征相符，不倡议送检mNGS 患者男，68岁，因“发热、畏寒7 d，咳嗽3 d”入院。血常规提示：WBC 为11.9×109/L，NEUT% 为93%，hsCRP 为110.3 mg/L，PCT 为2.1 ng/ml。胸部CT 检查示双肺多发结节、斑片影，外侧带明显。心脏超声：主动脉瓣退行性变伴轻度反流，三尖瓣轻度反流。入院当天送双侧双瓶血培育，同时给予左氧氟沙星（0.5 g，1次/d，静脉滴注）抗感染治疗，2 d后4瓶血培育报阳性，涂片提示革兰阳性球菌，药物调整为左氧氟沙星+万古霉素。治疗3 d后，患者仍发热，发热峰值稍降落，咳嗽咳痰较前加重，伴有胸痛、呼吸艰难，血氧饱和度维持在95%左右，复查血常规提示：WBC为10.1×109/L，NEUT%为89%，hsCRP 为99.8 mg/L，PCT 为1.6 ng/ml，血培育讲演为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。 作为主诊医师，你将为该患者选择怎样诊断计划？ A：中止支气管镜检查，肺泡灌洗液送检常规病原检测； B：中止支气管镜检查，肺泡灌洗液送检常规病原检测+mNGS（DNA）； C：不中止支气管镜检查，复查心脏超声，依据MSSA药敏结果更改抗菌药物治疗计划； D：不中止支气管镜检查，继续目前抗感染计划。 解析：患者以发热、畏寒为首发病症，伴炎症指标升高，患者已明白为MSSA的血流感染，胸部影像学提示双肺外侧带多发渗出，葡萄球菌血流感染惹起的迁移性病灶能够解释患者肺部影像学及临床表示，因而不倡议再留取BALF送检mNGS，需除外感染性心内膜炎（MSSA），倡议复查心脏彩超。选择计划C（参见共识中的问题3）。 患者转归：复查心脏超声提示三尖瓣右心室流出道面中等回声（10.6 mm×9.0 mm），思索赘生物，确诊MSSA，心外科会诊暂不手术，依据药敏结果抗感染药物改换为头孢唑啉，体温恢复正常，咳嗽、咳痰好转，炎症指标逐步降至正常，复查心脏超声赘生物减小，胸部CT 多发病灶消逝。 患者男，79岁。主因“重复咳嗽咳痰伴胸闷气促10余年，加重伴发热3 d”。于2022年4月6日入院。10年前诊断为“慢性阻塞性肺疾病”，近2年居家氧疗，长效支气管舒张剂吸入治疗。体检：体温38.1 ℃、BP为141/7 mmHg、HR为92 次/min、RR 为19 次/min。经鼻高流量氧疗35% 氧浓度，50 L/min 吸氧下指氧饱和度为93%~96%。神清，肉体弱。双肺听诊呼吸音粗，双下肺可闻及明显痰鸣音及湿性啰音，心律齐，无明显病理性杂音，双下肢可见中度凹陷性水肿。动脉血气剖析：pH 值7.33、PaCO2 为57 mmHg、PaO2 为72.5 mmHg。WBC 为7.98×109/L，中性粒细胞为 |
名表回收网手机版
