1.引言

乳状液能够简单地定义为“由两种不相容的液体组成的体系，其中一种以液滴(分散或内部相)的方式分散在另一种(连续相或外相)中”(Jafari等人，2008年)。乳状液是热力学上不利的体系，由于各种物理化学机制，随着时间的推移常常会合成。但是，经过运用强大的机械力和/或包含被称为稳定剂的物质，例如乳化剂，能够构成在合理时间内动态稳定的乳状液(McClements等人，2007年)。

高压均质机是最常用于消费食品乳状液的设备，可提供质地良好、稳定性更好的细微乳状液(Desumaux和Marcand，2002)。在这个过程中，激烈的剪切、空化和湍流条件的分离招致了脂肪液滴的破坏(McClements，2005)。脂肪滴平均尺寸的减小降低了乳化液的速度(斯托克斯定律)，并增加了乳状液的稳定性(德鲁莫和马尔坎德，2002)。另一方面，乳化剂是名义活性分子，在均化过程中吸附在新构成的液滴名义。一旦吸附到液滴名义，它们以两种方式起作用：降低界面张力和构成避免液滴汇集的维护层(Guzey和McClements，2006，McClements等人，2007，Walstra，2003)。

蛋白质具有两亲性，是食品乳状液中普遍运用的乳化剂/稳定剂。蛋白质能够在油滴之间产生排斥作用(如空间位阻和静电)，同时构成一层不易决裂的界面膜，这在长期贮存期间稳定油滴避免絮凝和兼并方面发挥了重要作用(McClements，2004)。乳清蛋白经常用于食品乳液体系，由于它们能够稳定水包油(O/W)乳状液(Dalgleish，1996，Dickinson，2001，Kerstens等，2006，Ye，2010)。吸附在油/水界面的乳清蛋白与吸附在同一液滴或不同液滴上的相邻分子经过非共价键或共价二硫键的组合相互作用，增加了分离的稳定性(McClements等人，1993)。此外，乳清分别蛋白(WPI)已被报道具有抗氧化活性(Hu等人，2003，Sun和Gunasekaran，2009，童等人，2000)，这对作为分散相的含有不稳定氧化成分的体系十分有利(Sun和Gunasekaran，2009)。

亚麻籽油富含不饱和脂肪酸，被公以为自然界中欧米茄-3的最大来源之一，这对人类健康具有积极影响，在降低心血管疾病风险方面的作用日益得到认可(Zhao等人，2007年)。但是，在加工、分配和处置过程中，由于高度的不饱和度，这些油很容易氧化(Tonon等人，2011年)。氧化会招致不高兴的滋味和气息的构成，从而缩短产品的保质期，此外还会促进自由基的产生，这可能会对生物体产生负面的生理影响(Tonon等人，2011年)。

因而，本研讨的目的是研讨制备乳清蛋白稳定的O/W乳状液的最佳条件，旨在进步亚麻籽油在贮存期内的稳定性，减少亚麻籽油的氧化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法调查了高压均质(20~100 Mpa)和均质次数(1~7次)对乳状液稳定性、液滴大小、流变性、氧化稳定性和分子量散布的影响。

2.资料和措施

2.1 资料

重新西兰乳制品(ALACEN 895，新西兰)和亚麻籽油(巴西Panambi，RS)取得乳清分别蛋白(WPI)，其脂肪酸组成如下：6.2%C16：0，5.3%C18：0，20.1%C18：1，13.7%C18：2和52.3%C18：3。蛋白质浓度由凯氏定氮法(AOAC，1997)、脂肪(Bligh and Dyer，1959)、水分(AOAC，1997)和灰分(AOAC，1997年)含量(湿基)分别为87.66±0.91%(N×6.38)、0.36±0.02%、4.54±0.11%和1.36±0.07%。其他试剂均为剖析级。

2.2 WPI原液的制备

WPI原液(5%w/v)由粉末在去离子水(pH 6.7)中于室温(25℃)下磁力搅拌90min制备而成。然后用2.0M氢氧化钠将溶液的pH值调理到7.0±0.2。该溶液在10℃下保存一夜，以使蛋白质完整溶解。

2.3 乳状液的制备

采用两种连续均质措施，在25℃下将水相油均质，制得水包油(O/W)乳状液。第一种措施包含将溶液在Ultra Turrax型T18型均质器(德国伊卡)中以14000转/分的速度混合4min。第二种措施包含运用Panda 2K NS1001L双级均质机(Niro Soavi，意大利)对先前制备的大乳液中止高压均质过程。第一阶段压力为20、40、60、80或100 Mpa，第二阶段固定为5 Mpa。还评价了在每个压力下经过均质器(1、2、3、4、5、6或7)的次数，总共产生35个乳状液。WPI和亚麻籽油含量分别固定在3%(w/v)和30%(v/v)。在乳状液中参与0.02%叠氮钠以避免微生物生长，并用2.0M氢氧化钠调理pH值至7.0。

2.4 乳状液稳定性

制备完成后，立刻倒入内径11 mm、高度94 mm的圆柱形玻璃管中，用塑料帽密封，在25℃下保存9d，经过底液相高度(H)随贮存时间的变更来权衡乳剂的稳定性。依据Eq测定乳化度指数(CI)(1)。

其中H表示乳状液的初始高度。为了便于察看相分别，在亚麻籽油中参与了苏丹III(微红色染料)。剖析工作一式两份中止。将均质压力分别为20和80 Mpa的乳状液保存在25℃的玻璃瓶中(60 mL乳状液，内径为45 mm，高度为70 mm)，保存3个月。

2.5 光学显微镜

寄存1d后，对乳状液的微观结构中止了评价。将样品倒入显微镜载玻片上，盖上玻璃片，运用Carl Zeiss Model Axio Scope。A1光学显微镜(蔡司，德国)和X100物镜中止察看。

2.6 颗粒大小散布

运用Mastersizer 2000(马尔文仪器有限公司，英国)来测定乳剂的粒度散布。在分散装置中搅拌时，将约0.1mL的乳状液参与150mL 0.06% v/v的蒸馏水中。依据EQS，油滴的平均直径表示为体积平均直径(D)，分散指数(SPAN)也被讲演(2)、(3)。乳剂制备后1d中止剖析，每份样品一式三份。

其中，N是具有直径di的颗粒的数量，D、D和D分别是累积体积为10%、50%和90%的直径。

2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)

依据Laemmli(1970)的说法，在恢复和非恢复条件下，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)评价了O/W乳液高压均质所产生的蛋白质的分子量散布。在解离的非恢复条件下，发作由静电和疏水相互作用稳定的蛋白质汇集体的断裂。而在解离恢复条件下，蛋白质的游离巯基之间构成的二硫键相互作用决裂。采用垂直平板Mini-Protean电泳系统(美国加利福尼亚州鼎力神Bio-Rad实验室)，分别凝胶和堆积凝胶中分别含有15%和5%的丙烯酰胺。将整个乳状液在去离子水(2 mg 蛋白质/mL)中稀释，所得溶液在样品缓冲液(1：1)中稀释，取得解离的非恢复条件(50 mM ris-HCl(pH 6.8)，加2%十二烷基硫酸钠(w/v)，10%甘油(v/v)和0.1%(w/v)溴酚蓝)和解离恢复条件(50 mM Tris-HCl(pH 6.8)，加2%十二烷基硫酸钠(w/v)，10%甘油(v/v)，0.1%(w/v)溴酚蓝和5%(v/v)β-硫醇)。在离解条件下，样品在70℃下热处置5min，10μL等分，然后装入堆积凝胶中的聚丙烯酰胺孔中。凝胶在100V下运转，运转缓冲液(pH 8.3)包含25 mM Tris-HCl，250 mM甘氨酸和0.1%(w/v)十二烷基硫酸钠。然后用0.25%(w/v)考马斯亮蓝在乙醇：醋酸：水(45：10：45 v/v)中染色，并在乙醇：醋酸：水溶液(10：5：85 v/v)中重复洗濯扩散脱色。以自然乳清蛋白溶液(非变性)为参照，运用商业分子量标记(预染色的InvitrogenTM BENCH Marker蛋白质梯形图，BioAgency International，美国杰克逊维尔)来控制分子量。

2.8 流变学丈量

运用Physica MCR301模块化紧凑型流变仪(德国Anton Paar)，不锈钢板几何外形(75 Mm)，间隙0.7 mm用于丈量。乳状液放置1d后中止评价，并在25℃下中止一式三份的丈量，运用UP-DOWN-UP STEEP程序取得剪切速率在0到300s范围内变更的活动曲线(4)对活动曲线中止拟合。

其中σ为剪切应力(P)，为剪切速率(s)，k为稠度指数(P.s)，n为活动特性指数(无量纲)。

2.9 氧化稳定性

对WPI稳定的乳液在室温下寄存30d期间的过氧化值(PV)中止了评价。这些乳剂被放置在密封的瓶子里，并用铝箔掩盖，以避免裸露在阳光下。还对只含有亚麻籽油的对照样品中止了剖析。

过氧化值(PV)按IDF规范措施(Shantha和Decker，1994)用分光光度法测定。首先，将0.3mL乳状液参与1.5mL异辛烷/异丙醇(3：2，v/v)，一式三份地从乳状液中提取油。然后将混合物旋转三次，每次10秒，然后静置30min。放置后，搜集清澈的上溶剂层0.2mL，与2.8mL氯仿/甲醇(7：3，v/v)混合，再次旋转(4s)。然后参与硫氰酸铵溶液(15μL)，样品在涡流混合器上混合4s。最后参与15μL铁(II)溶液，样品再次旋转4s，室温孵育5min后，运用UNICO Spectrquest2800UV/Vis分光光度计(United Products&Instruments Inc.，美国新泽西州)，在500 nm处相关于包含除样品外的一切试剂的空白测定样品的吸光度。整个过程在昏暗的光线下中止，并在3min内完成。过氧化氢浓度用Fe+3规范曲线测定，铁浓度从1到20μg变更，如Shantha和Decker(1994年)所述。过氧化值，以每千克油中过氧化氢的毫当量表示，用公式计算(5)。

式中，As=样品的吸光度，Ab=空白的吸光度，m=校准曲线的斜率，M=油的质量(G)，55.84=铁的原子量。结果除以系数2，用过氧化值的毫当量而不是氧气的毫当量来表示过氧化值。

2.10 统计剖析

结果用方差剖析(ANOVA)中止评价，用Tukey程序评价处置间的显著差别(p<0.05)。运用统计软件STATISTICA 6.0(Statisoft Inc.，Tulsa，USA)中止统计剖析。

3.结果与讨论

3.1 乳状液的乳化性稳定性

一切经高压(20~100 Mpa)均质的乳剂，无论经过均质机的次数(1~7次)，均表示出良好的稳定性，在圆柱形玻璃管(乳状液10mL，内径=11 mm，高度=94 mm)中贮存长达9d，没有呈现相分别的迹象，构成顶部乳膏相和底部血清相。

为了减少壁面效应，在20和80 Mpa下均质1次、4次和7次的乳状液经过均质机，在25℃下在玻璃瓶(60mL乳状液，内径=45 mm，高度=70 mm)中中止了3个月的稳定性测试，由于众所周知，限制壁能够对球形粒子在液体中的沉淀起到额外的障碍作用(Chhabra等人，2003年)。但是，在这些条件下，即便在贮存3个月后，乳液依旧没有显现出相分别(图1)。

图1.贮存3个月后在20和80Mpa下均质的O/W乳状液的外观。传球次数：(A)1、(B)4及(C)7

3.2 微结构和液滴大小

用光学显微镜研讨了不同压力和均质次数对乳状液结构的影响。乳状液的微观图像表明，增加均质压力和经过次数，减小液滴尺寸，这与另一项研讨(Qian和McClements，2011，Santana等人，2011)分歧。但是，在高压下，增加经过次数似乎促进了乳液滴的兼并，如图2所示。

图2.在20和80 Mpa下均质的O/W乳状液的微观结构分别为1、4和7，经过均质机。比例尺=10μm。

图3显现了在20和80Mpa下均质的乳状液的粒度散布随均质器经过次数的变更(分别图3A和B)。结果表明，在较低的均质压力下(20 Mpa)，随着道次的增加，油滴尺寸散布的宽度明显减小，油滴愈加细小，分散更平均。但是，当压力增加到80 Mpa时，乳状液粒子的散布变为双峰散布，这表明可能发作了液滴-液滴的汇集(兼并)。对在20和80 Mpa下均质的乳液的平均液滴直径和跨度或分散指数的评价(表1)显现，在20 Mpa下，d值显著降低(p<0.05)，最多7次经过均质器，如图3A所示。在较高的均质压力(80 Mpa)下，最多3次均质，液滴尺寸最小(D)。但是，能够看到，从5次经过均质器时，d值显现出显著的增加，这表明液滴重新汇集，这也能够从较高的SPAN值中察看到。固然产生了十分小的颗粒，但它们可能会立刻重新分离，招致严重均化条件下的低乳化效率。这可能与WPI在液滴界面上的吸附速率较低有关，这将产生以下结果：在均质阀中的液滴变形和决裂期间，一些新液滴可能在很短的时间内未被掩盖，或者部分新界面可能未完整被掩盖(Jafari等人，2007年)。同时，液滴碰撞的速率(频率)将十分高，特别是在较高的能量密度(压力)下。因而，更多的能量输入、更高的体积流量和更短的停留时间的组合可能会招致更激烈的重新聚会和更大的乳化液滴尺寸，从而构成双峰散布(Jafari等人，2007年)。

图3 均质压力和经过均质器的次数对在20和80Mpa下均质的含有3%wpi和30%亚麻籽油的乳状液的液滴尺寸散布的影响

表1.由WPI稳定的O/W乳状液的平均液滴直径(μm)和跨度

高压均质和经过均质器的次数增加与以热的方式更大地耗散机械能有关，从而招致乳化液的温度升高。因而，在每次经过后，在20和80Mpa的压力下，在均质器的出口处丈量O/W乳状液的温度，结果如图4所示。依据结果，能够看到，压力的增加和经过均质器的次数的增加，招致了乳状液的温度升高，Sandra和Dalgleish(2005)和Santana等人也察看到了这一点(2011)。依据Hayes和Kelly(2003)的说法，温度的升高是由于绝热加热，以及高压均化过程中的高湍流力、剪切力和空化力。在80 Mpa下，均质机4次后，乳清蛋白中含量第二高的组份α-乳清蛋白(α-La)(22%)的变性温度抵达62℃，6次后，含量最低的组分牛血清白蛋白(BSA)(5.5%)的变性温度抵达64℃(Bryant and McClements，1998)。因而，在高压(表1)和温度(图4)下，液滴尺寸(D)随着经过均质器的次数增加，也可能招致蛋白质的展开、裸露和疏水基团之间经过构成共价键而相互作用，从而招致乳化才干降低，促进液滴兼并。

图4 均质压力和均质次数对均质机出口处含有3%和30%亚麻籽油的乳状液温度的影响，均质压力：(□)20和(X)80Mpa

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)肯定高压均质过程和均质器的经过次数能否会由于乳状液中察看到的温度升高而招致蛋白质汇集(图4)。在20Mpa下均质并稀释以取得非恢复和恢复条件的乳状液分别如图5A和B所示，而在80Mpa下均质并稀释以取得非恢复和恢复条件的乳状液分别如图5C和D所示。图5A和图C显现了在压力分别为20和80Mpa的状况下，每次经过后均质器出口处抵达的温度。

图5.在Ultra Turrax和高压下均质的O/W乳状液的聚丙烯酰胺凝胶电泳，均质器经过均质器的次数不同

图5.在Ultra Turrax(14000转/分)和高压(20和80Mpa)下均质的O/W乳状液的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，均质器经过均质器的次数不同。(A，B)20Mpa和(C，D)80Mpa。(A，C)非恢复条件下的SDS-PAGE和(B，D)恢复条件下的SDS-PAGE。柱子(1)商品分子量标记，(2)自然乳清蛋白溶液(非变性)，(UT)Ultra Turrax，(P1)1次，(P2)2次，(P3)3次，(P4)4次，(P5)5次，(P6)6次和(P7)7次。细致显现了每次经过后均质机出口抵达的温度。

在不同均质条件(压力和道次)下，在15 kDa和19 kDa左右的分子量区域分别呈现了两条主带，分别对应于α-乳球蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)的级分。此外，在26-37 kDa和64 kDa左右的相对分子质量区域分别察看到与β-LG二聚体和牛血清白蛋白组分相关的小条带。

依据图5A和B，在20Mpa下均质的乳液中没有构成高分子量的蛋白质汇集体，这能够解释为每次经过均质器后抵达的较低压力和较低的温度。但是，当压力增加到80Mpa时，能够看到，只需1次经过均质机，就曾经有一些分子量超越64 kDa的汇集体构成，并且在4次和5次之后增强(图5C)。因而，必须指出，固然经过较少的次数后还没有抵达乳清蛋白组分的变性温度，但压力促进了高分子量汇集体的构成。高静水压力对蛋白质的影响主要与突破非共价相互作用(疏水和静电)有关，招致球状蛋白质的四级和三级结构被破坏，对其二级结构影响相对较小(Bouaouina等人，2006年)。经过均质机4次和5次后，随着温度的升高，这种汇集过程变得愈增激烈。部分球状乳清蛋白的展开能够招致更紧密的吸附层，暴显露活性硫基(Singh和Sarkar，2011)。因而，吸附在界面上的蛋白质分子之间能够发作巯基二硫键交流反响，招致液滴周围蛋白质膜的名义粘弹性增加，这能够解释这些乳状液抗聚结的稳定性(Dickinson等人，1990年，Dickinson和MatSumura，1991年，McClements等人，1993年)。

在非恢复条件下(图5C)，在堆积凝胶中也能够看到高分子量蛋白质汇集体的构成，这可能相当于分子量超越200 kDa(Copeland，1990)。但是，在β-巯基乙醇存在下，这些汇集体发作了相当急剧的减少(图5D)，表明它们是经过二硫键稳定的。因而，凝聚过程也能够经过乳清蛋白组分的减少来评价，主要是在6次和7次之后，同时在经过均质器的较高次数(4-7次)后堆积凝胶中构成高分子量汇集体。低分子量蛋白质逐步从电泳谱中消逝也与11S大豆蛋白稳定的乳状液中随着压力的增加(从400Mpa)的汇集过程有关。在吸附和未吸附的蛋白质中都察看到了这种行为，这表明无论蛋白质在哪里(水相或界面)，高压的运用都会诱导这种球状蛋白质的汇集(Puppo等人，2011年)。

3.4 流变学

在高压下均质不同均质器次数的WPI稳定乳状液的活动曲线数据与一切乳状液的幂函数模型方程(R>0.993)契合得很好。表2还显现了剪切速率为100 s时的表观粘度。由于这是典型的食品加工过程，如流经管道、搅拌或咀嚼(McClements，2005)，因而在该剪切速率下对该参数中止了评价。O/W乳液表示出较低的假塑性，由于一切乳液的活动行为指数(N)都在0.78-0.95之间。依据表2，通常能够察看到，稠度指数(K)随着经过均质器的次数的增加而增加，而活动行为指数(N)的值则减小，这分别表明O/W乳液的粘度和假塑性增加。均质压力和经过次数的增加招致乳液粘度的增加，这从100s(η)的表观粘度值能够看出，这可能与更高的蛋白质汇集性和平均液滴尺寸有关。

表2.由幂定律模型取得的流变性参数和由WPI稳定的O/W乳状液在100s时的表观粘度(η)

3.5 脂类氧化

经过丈量在高压下均质的O/W乳剂中初级反响产物(脂质过氧化氢)的构成来监测脂质氧化的停顿(图6)。在20Mpa下均质的乳液显现出比纯油更低的过氧化值或统计上相似的过氧化值，但在贮存30天后(7次)(图6A)。乳化剂(蛋白质)的存在阻止了一些助氧化剂杂质(如过渡金属)的分离，从而避免了油氧化(Fomuso等人，2002，McClements和Decker，2000)。而纯油在贮存30d后，过氧化值仅从0.420上升到0.714 meq/kg oil。当压力增加到80Mpa时，相关于纯油(图6B)和在20Mpa下均质的乳状液(图6A)，乳状液中初级氧化产物的构成增加，这可能是这些乳状液(图4)中察看到的温度升高的结果(沙希迪和钟，2005年)。此外，液滴尺寸(D)随压力的增加而减小(表1)也可能影响氧化的增加，由于液滴的名义积增加。依据McClements和Decker(2000)的说法，发作在乳液滴名义的反响能够加速脂类的氧化。因而，随着液滴尺寸的减小，脂质氧化的速度应该会加快，由于较小的液滴在界面上对促氧化剂裸露了更大的单位体积名义积(Lee等人，2011，McClements和Decker，2000，Osborne和Akoh，2004)。均质压力为80 Mpa的乳状液，在均质1次后过氧化值由0增加到1.777 meq/kg oil，4次均质后过氧化值从0增加到0.847 meq/kg oil，7次均质后过氧化值从0.026增加到2.957 meq/kg oil。此外，一次氧化产物似乎在30d后继续增加，而在纯油中，它们仅从0.401增加到0.647 meq/kg oil(图B)。在乳状液和纯油中察看到的氧化增加能够被以为是很小的，由于WPI可能在乳状液中起到抗氧化剂的作用。此外，剖析中运用的低温(25℃)可能阻止了更大的氧化，由于依据Pu和Sathivel(2010)的说法，30℃下的亚麻籽油随着时间的推移表示出最小的脂肪氧化，但随着温度的升高(30-60℃)显现出更高的过氧化值。

图6均质压力和均质次数对含有3%WPI和30%亚麻油的乳状液在20和80Mpa下均质的过氧化值的影响

4.结论

研讨结果表明，乳清蛋白稳定的乳状液在高压(20~100 Mpa)下均质，均质次数不同(1~7次)，稳定性好，无相分别现象。均质压力从20 Mpa增加到80 Mpa，循环次数增加到3次，O/W乳状液的平均液滴尺寸变小。但是，较高的压力和较多的道次招致液滴兼并，并由于剪切和温度的升高而构成高分子量的蛋白质汇集体，从而降低了其乳化才干。此外，O/W乳状液的粘度增加和初级氧化产物的构成，后者是由较高压力下乳状液的温度升高和液滴尺寸减小(名义积增加)解释的。因而，当以进步稳定性和减少亚麻油在O/W乳状液中的氧化为目的时，最佳工艺条件是运用20Mpa的均质压力，并经过均质器最多5次。