溶酶体贮积症（lysosomal storage disorders，LSDs）是一组由溶酶体酶或功用相关蛋白缺陷所致的高度异质性疾病，累及多个组织器官，表示方式多样。每年活产婴儿发病率为1/5 000~1/7 000。临床治疗以酶替代疗法（enzyme replacement therapy，ERT）为主，但该疗法对具有神经系统病症的LSDs患者疗效甚微。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是靶向中枢神经系统的“明星载体”，其介导的基因治疗在部分LSDs动物实验和临床实验中都取得了较好疗效，有望成为治愈LSDs的方式。本文总结了目前AAV在常见LSDs的动物实验及临床实验状况，为AAV介导的基因疗法在LSDs中的应用奠定基础。

1.LSDs概述

LSDs主要是由编码溶酶体功用相关的水解酶或蛋白基因突变所致。由于这些酶或蛋白的缺陷，溶酶体不能正常降解大分子底物，未被降解的大分子底物在细胞内逐步累积，当贮积到一定水平时会招致细胞功用障碍和细胞死亡。截至2021年12月1日，世界研讨会溶酶体病官方名单（worldsymposia.org/official-list-of-lysosomal-diseases）已发布68种LSDs。该病的临床表示方式多样，可有多个器官系统受累，超越2/3的患者有神经系统受累，疾病的严重水平与酶残留活性呈负相关。该病主要治疗措施有ERT、造血干细胞移植、基因治疗和对症支持治疗。随着治疗时间的延长，运用ERT的患者可能会由于对外源性酶产生免疫反响招致疗效降落，此外，血脑屏障的存在限制了有神经系统病症患者的给药途径［5］。造血干细胞移植技术自身比较成熟，在LSDs中的应用逐步增加，对疾病早期和非中枢神经系统受累的患者部分有效，但需求找到适合的供者，这使得造血干细胞移植只短谥部LSDs患者有效。迄今，基因治疗在LSDs中的应用仍处于前临床及临床实验阶段，但已完成的实验结果提示其具有较好疗效，特别是在具有神经系统病症的LSDs患者中。LSDs基因治疗的载体主要有AAV、逆转录病毒、慢病毒（表1），其中AAV应用最为普遍。

3种病毒载体的特性

2.AAV载体概述

AAV是一个小型的、无包膜的二十四面体病毒，由Rep、Cap 2个开放阅读框（open reading frame，ORF）和包含145个核苷酸的2个末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）组成，其基因组为单链线性DNA（4.7 kb）（图1）。ITR是由2个回文序列互补构成的T型发卡结构，在AAV的复制、包装和整合中起着十分重要的作用。Rep ORF编码4种非结构蛋白，分别是Rep78、Rep68、Rep52和Rep40；Cap ORF编码4种结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3和APP蛋白。用于基因治疗的AAV载体通常为重组AAV（recombinant adeno-associated virus，rAAV），即野生型AAV中的rep和cap基因被基因表白盒（1个启动子、1个目的基因、1个转录终止信号）所取代，只保存两端的ITR（图1）。

野生型和重组型AAV的结构

AAV有十多种血清型，不同血清型具有不同的组织和细胞趋向性。在基因治疗中常依据靶器官选择rAAV的血清型和启动子。构建治疗LSDs的rAAV常用启动子有巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子、分离蛋白（desmin，DES）启动子、巨细胞病毒增强/β肌动蛋白（CMV enhancer/β-actin，CB）启动子、肝脏特异性启动子（liver specific promoter，LSP）等。

迄今，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh.10已被用于中枢神经系统疾病的实验（表2）。科学家们不时努力于开发转导效率更高和组织趋向性更强的AAV，好比AAV2/1、AAV-DJ、AAV-PHP.B、AAV2-7m8等。至今已有5种与AAV相关的基因治疗药物被批准上市，分别是Glybera（治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症）、Luxturna（治疗遗传性视神经炎）、Zolgensma（治疗脊髓性肌萎缩症）、Upstaza（治疗芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症）和Roctavian（治疗血友病A）。

靶向中枢神经系统的AAV常见血清型

3.AAV介导的基因治疗在LSDs中的应用

在PubMed数据库中以“adeno-associated virus”“AAV”“lysosomal storage disorder”“lysosomal storage disease”“LSDs”为关键词中止检索，发现近十年有200多篇文章，触及法布里病、戈谢病、黏脂贮积症等，其中黏多糖贮积症（mucopolysaccharidosis disease，MPS）80余篇，Pompe病（Pompe disease）50余篇，神经元蜡样质脂褐质堆积症（neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL）20余篇。此外经过检索临床研讨网站（clinicaltrals.gov和clinicaltrialsregister.eu），发现截至2022年7月16日AAV在LSDs上的临床研讨多集中在Pompe病、MPS、NCL（表3）。因而，我们重点论述AAV载体在这3种疾病中的停顿。

3.1. Pompe病

Pompe病又称糖原贮积症Ⅱ型（glycogen storage disease type Ⅱ，GSD Ⅱ），是一种由17号染色体酸性α-葡萄糖苷酶（acid α-glucosidase，GAA）缺乏所惹起糖原在心脏、骨骼肌和运动神经元中积聚的遗传代谢性疾病。依据发病年龄分为婴儿型和晚发型。婴儿型Pompe病以心脏受累为主，晚发型Pompe病多累及运动神经元，两者预后均不佳。自2006年ERT面世以来，给许多患者带来希望。

但是ERT的局限性逐步显现：

（1）抗体反响：不少患者运用后呈现持续高抗重组人类α-葡萄糖苷酶滴度状态；

（2）治疗周期长，需求频繁注射，具有输液相关风险；

（3）重组的蛋白不能经过血脑屏障，无法治疗有神经系统病症的患者，对晚发型Pompe病患者治疗效果不佳。

从2002年开端，以AAV作为载体治疗Pompe病的研讨曾经在动物中得以展开，并不时优化以促进其临床应用：

（1）从单一血清型的AAV到杂交血清型的AAV；

（2）不时优化rAAV的战略，如依据靶向器官选择CMV、DES、CB、LSP等启动子；

（3）改进给药方式：婴儿型Pompe病多选择静脉注射、肌内注射；晚发型多选择中枢神经系统靶向治疗，肝定向治疗在成人患者中也是一种措施。

Falk等发现与ERT治疗的小鼠相比，AAV2/9-DES-hGAA治疗后的GAA -/-小鼠在心肌和呼吸肌中显现GAA活性增加，糖原积聚减少。此外，AAV2/9-DES-hGAA治疗后的GAA -/-小鼠呼吸功用有显著变更，表明部分纠正了下运动神经元功用。Lee等发现脑室内注射AAV9/3-Syn-I-hGAA后，经过降低大脑和脊髓的糖原积聚，减少星形胶质细胞增生和增加髓鞘构成，使Pompe病小鼠的运动谐和功用得以改善。2009年，用于治疗Pompe病的AAV临床实验（NCT00976352）初次在佛罗里达大学展开，该实考证明rAAV1-hGAA对治疗慢性呼吸机依赖的Pompe病患儿是有效战争安的，但该实验只归入10名患儿。近年来，越来越多相关的临床实验已展开（clinicaltrials.gov），2016年展开“在晚发型Pompe病患者中肌内注射重组AAV酸性α-葡萄糖苷酶（rAAV9-DES-hGAA）”的Ⅰ期对照研讨（NCT02240407），评价该载体的毒理学、生物散布和潜在活性；2018年至今展开的临床研讨多集中在“不同的重组腺相关病毒［AAV2/8-LSPhGAA(ACTUS-101)、AT845、SPK-3006］在晚发型Pompe病中的应用”，旨在探求用于晚发型Pompe病的rAAV血清型和启动子最佳组合战略。“可用于治疗Pompe病的组合物”的专利（CN114127275A）在2022年2月经过，该专利提供了一种可用于治疗Pompe病的rAAV-AAVhu68.CB6.hGAA 。固然目前很多临床实验仍处于停顿阶段，但依据动物实验及已完成的临床实验结果不难发现，对晚发型Pompe病患者而言，AAV介导的基因治疗似乎是一种更可行的治疗措施。

3.2. MPS

MPS是由降解黏多糖的酶缺乏所惹起的多组织器官受损的一组疾病，发病率为1/25 000~1/30 000。依据特定酶的缺乏将MPS分为7种类型，其临床表示多样，常累及多个器官系统。其中MPS Ⅱ型为最常见的类型，而MPS Ⅲ型神经系统受累最严重，可招致神经退行性变、中止性智力障碍和发育倒退。2020年国内首个ERT特异性治疗药物——艾度硫酸酯酶β注射液上市，填补了MPS Ⅱ的临床治疗的空白。ERT曾经普遍用于MPS Ⅳ、Ⅱ、Ⅳ-A、Ⅵ、Ⅶ型，但在有神经系统病症的MPS中疗效甚微。造血干细胞移植疗法固然能够治疗有神经系统病症的MPS，但对MPSⅢ型无效。因而，近年来美国及一些欧洲国度展开了该病的基因治疗，主要触及MPS Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。Hinderer等研讨表明，鞘内注射AAV9-hIDUA能够减少MPS Ⅰ型小狗的脑生化异常和底物的积聚，具有剂量依赖性；此外，在MPS Ⅰ、ⅡB型小狗实验中证明单次注射AAV5.5-hIDUA、rAAV5-hNAGLU能够治疗和预防其神经系统的病理改动，且该实验结果能够重复，为临床实验的展开奠定了基础。Hinderer等发现将AAV9.CB.hIDS递送到脑脊液能够作为MPS Ⅱ型小鼠中枢神经系统高效、长期递送酶的平台；Winner等发往常MPS Ⅲ A大鼠脑实质内给予AAVrh10-SGSH-IRES-SUMF1能够完成普遍的酶散布和更好地矫正病理改动；Gutiérrez等构建出含有人GALNS基因并由CMV免疫早期启动子驱动的AAV衍生载体，完成了MPS Ⅳ型基因治疗的第一步。目前大多临床实验都集中在MPS Ⅲ型（NCT02053064；NCT04088734；NCT03612869；NCT04655911；NCT04360265），固然这些临床实验结果目前仍未报道，但就动物实验的结果而言，AAV介导的基因治疗在MPS中有较好的前景，其rAAV构建中，仍以AAV9血清型最为常见，启动子以CB为主，常用注射方式为鞘内注射。此外，专利“一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用”（CN 111110865 A）在2020年5月经过，该发明为MPS Ⅱ型的临床治疗提供了有效的治疗伎俩。AAV介导的基因疗法有望成为伴神经系统损伤的MPS患者的优先疗法。

3.3. NCL

NCL又称为Batten病，是一组由脂褐素堆积所致的中止性加重的神经退行性疾病，以智力和运动功用障碍、癫痫、痴呆、视力减退为主要表示。至今已有14个基因（CLN1~CLN14）被报道与该病相关（www.ucl.ac.uk/ncl）。研讨表明，不需求经过血脑屏障的ERT，如鞘内注射，能够显著缓解神经系统病症，减缓病程。目前只需CLN2缺陷患者的脑室内ERT——Brineura被美国食品药物管理局批准，但仍需终生注射。其他NCL主要予抗癫痫药物对症治疗。Cabrera-Salazar等和Sondhi等研讨表明颅内注射AAVrh10.hTPP1和AA2/1.hTPP1的CLN2 -/-大鼠有更好的运动功用、更长的寿命、反响性胶质细胞的增生及轴突变性状况的减少。Sondhi等在CLN3 -/-的重生小鼠中中止颅内注射AAVrh.10.CAG.hCLN3后发现，堆积的物质和星形胶质细胞活化减少，但在18个月时未治疗的小鼠未呈现明显的运动缺陷，故未评价其行为和运动功用。

另一个研讨也表明，静脉注射AAV2/9.hHCLN3能够纠正CLN3 -/-小鼠的运动缺陷。Kleine Holthaus等发往常CLN6 -/-重生小鼠的双侧脑室内注射AAV9.hCLN6后，小鼠寿命延长90%以上且在给药后23个月内坚持运动功用。Mitchell等对CLN5 -/-的羊中止颅内注射AAV2/9后，其生存时间也显著延长。NCL动物实验中rAAV的构建主要以较为成熟的AAV2/9血清型为主，这些实验都为NCL临床实验的展开奠定了基础。2004年，第一个AAV介导的基因治疗实验在CLN2缺陷患儿中中止（NCT00151216），该实验归入了11名儿童，分为中度（6名）和重度（5名）2组，经过手术直接颅内注射AAV2CUhCLN2，随访4年后Worgall等发现该治疗减慢了疾病进程，但有一名受试者在第14天呈现癫痫持续状态并在术后49 d死亡，未发现中枢神经系统炎症的证据；40%患者对AAV2衣壳蛋白呈现细微、短暂的体液免疫反响。故为进一步评价AAV介导CLN2基因治疗的保险性和有效性，又展开了临床实验NCT01414985、NCT01161576，并针对之前呈现的体液反响，将rAAV载体血清型调整为AAVrh.10，目前结果未见相关报道。CLN6、CLN3和CLN7的临床实验NCT02725580、NCT03770572、NCT04737460目前也在展开中。与此同时，越来越多NCL AAV介导的基因疗法的专利被发明。2021年以来，曾经过ScAAV9.CB.CLN6、ScAAV9.P546.CLN3、AAV2-CAG-人TPP1等rAAV专利，这些专利进一步推进了AAV介导的基因疗法在NCL的临床应用。

4.瞻望

AAV作为基因治疗中的“明星载体”，截至2022年9月15日在ClinialTrials.gov注册的AAV临床研讨高达292项。但是，AAV介导的基因治疗也存在一些局限性：

（1）许多人的血清中存在一些AAV血清型的抗体，好比AAV2、AAV1、AAV9，此外这些抗体可能与其他血清型会发作抗体反响；

（2）小容量性，AAV的容量仅4.7 kb；

（3）多数基因治疗存在的共同问题，好比潜在的致瘤性和不可预测的风险。

随着基因工程的展开，这些问题被不时优化，如在治疗前，先筛查患者体内的AAV抗体；经过双载体或三载体进步其基因容量性。从上述内容中，我们发现AAV介导的基因疗法已在小鼠、猫、狗、羊等动物中展开；目前已完成的临床实验结果表明AAV介导的基因治疗有望成为治愈LSDs患者的有效伎俩，特别是在Pompe病、MPS、NCL等病中。

固然如此，AAV介导的基因疗法在LSDs的临床应用中仍有很长的路要走。就给药方式而言，固然中枢神经系统在免疫上具有“特权”，较少发作免疫反响，但多次颅内给药仍可能会招致癫痫发作，以至使神经系统病症的LSDs转变成内脏病症的LSDs。此外，目前所展开的临床实验存在一个共性——归入的受试者较少。再者，其费用也是医患关注的问题，2021年治疗脊髓肌萎缩症的诺西那生钠注射液归入医保后，每支从70万元降至3.3万元，给很多稀有病家庭带去了希望。随着基因治疗产业链的不时完善及国度医保的鼎力支持，置信会有越来越多家庭受益于基因治疗。

文献来源

Lin XQ, Wang XL, Peng J. 腺相关病毒介导的基因疗法在溶酶体贮积症中的应用 [Application of adeno-associated virus-mediated gene therapy in lysosomal storage diseases]. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2022 Nov 15;24(11):1281-1287. Chinese. doi: 10.7499/j.issn.1008-8830.2207055. PMID: 36398557; PMCID: PMC9678058.